Подсчет клеток эндотелия роговицы при
Передняя часть глазного яблока представлена роговицей. Существует множество заболеваний и состояний, которые меняют ее клеточный состав.
Чтобы их выявить, применяют эндотелиальную микроскопию роговицы глаза.
Это неинвазивная процедура, осуществляемая с помощью микроскопа последнего поколения. Главным его преимуществом является точность и отсутствие соприкосновения окуляра с поверхностными структурами глаз. На основе полученных данных можно поставить достоверный диагноз и начать лечение.
Показания к обследованию
Эндотелиальная микроскопия проводится не всегда, только по показаниям. Для этого у пациента должна появиться клиническая симптоматика:
- помутнение, отек роговицы;
- появление рубцов на роговице;
- снижение остроты зрения;
- изменение толщины роговицы;
- нарушение рефракционной способности глаз, что приводит к миопии или близорукости.
Методику применяют для определения следующих заболеваний:
- воспаление сосудистой оболочки глаза (увеит);
- глаукома – повышение внутриглазного давления за счет притока секретируемой жидкости в камеры глаз;
- дистрофия поверхностных структур глаз;
- кератит – воспаление роговицы.
Процедуру рекомендовано проводить перед осуществлением хирургического вмешательства, чтобы выявить состояние поверхностных структур органов зрения. Если роговица истончена, клетки находятся далеко друг от друга, это прямое противопоказание к проведению хирургического вмешательства.
Методика также показана перед проведением трансплантации роговицы. При этом донор и реципиент должны совпадать по клеточному материалу пересаживаемой ткани.
Процедуру проводят для мониторинга за состоянием тканей после проведения хирургического вмешательства. С помощью микроскопии выявляется степень приживления клеток, качество роговицы после разреза.
Противопоказания
Процедура не относится к инвазивным. Она не причиняет боль, проводится очень быстро, поэтому ее можно применять даже к категориям пациентов, у которых наблюдается повышенная чувствительность глазных яблок. Время выполнения – несколько минут. Методика выполняется для людей разных возрастов, она возможна как для младенцев, так и для пожилых людей.
Единственное противопоказание к проведению процедуре – наличие лежачего больного. Аппарат действует только для людей в сидячем положении.
Данные могут быть некорректными или вовсе не выполнимыми при следующих состояниях:
- сильное помутнение, рубцевание роговицы;
- сильный отек роговицы.
Процедура полностью невыполнима, когда не определяются даже границы клеток, что образуется вследствие сильнейшего помутнения и изменения структуры эндотелия.
Что показывает эндотелиальная микроскопия
С помощью методики можно рассмотреть различные параметры поверхностного слоя роговицы:
- плотность прилегания клеток друг к другу;
- разница в размерах ближайших идентичных клеток;
- количество клеток правильной и неправильной формы;
- определение темных зон, которые проявляются после воспалительных состояний, после операционных вмешательств.
Методика позволяет изучить все эти показатели при жизни. То есть для проведения микроскопии не требуется извлечения кусочка ткани.
Как происходит обследование
Процедура проводится в несколько этапов:
- глаза и кожные поверхности должны быть чистыми, поэтому перед процедурой рекомендуется промыть эти области проточной водой или с помощью антисептических средств;
- человек садится перед микроскопом, на его глаза наводят окуляр;
- глаза должны быть открытыми в течение нескольких секунд, за это время происходит фотографирование различных зон роговицы.
Специфической подготовки к проведению процедуры не требуется.
Расшифровка результатов
Врач-лаборант выдает бланк, на котором записаны различные показатели строения роговицы. Его необходимо отнести к лечащему врачу, чтобы он произвел расшифровку, рассказал, нормальны ли результаты, назначил лечение. На бланке исследования будут обозначены следующие результаты:
- плотность клеток эндотелия на 1мм2;
- коэффициент полимегатизма клеток;
- плеоморфизм (размер, строение, форма клеток, которая отличается или идентична нормальным клеточным элементам роговицы);
- отсутствие просматривания эндотелия (темные зоны).
С помощью эндотелиальной микроскопии роговицы выявляются параметры, не доступные для определения невооруженным взглядом. До настоящего момента такие данные определялись только при биопсии, которая осуществлялась не при жизни, а после смерти пациента. С помощью методики можно подготовиться к операционному вмешательству, следить за состоянием пациента после его проведения.
Полезное видео
Была ли статья полезной?
Оцените материал по пятибальной шкале!
Если у вас остались вопросы или вы хотите поделиться своим мнением, опытом — напишите комментарий ниже.
Что еще почитать
Источник
Эндотелий роговицы представляет собой один слой плоских гексагональных (шестигранных) клеток, выстилающих заднюю поверхность роговицы и входящих в соприкосновение с содержимым передней камеры глаза.
Основная функция эндотелиальных клеток – насосная, именно благодаря работе этих клеток происходит отведения избытка жидкости из роговицы. Основной опасностью, которая подстерегает роговицу при нарушении функции насосной системы эндотелия, является значительное уменьшение прозрачности роговицы, вплоть до состояния, когда последняя становится похожей на матовое стекло.
Многочисленные воздействия могут нарушить обмен веществ эндотелия роговицы и таким образом повредить саму роговицу: операции на глазах, воздухонепроницаемые контактные линзы, химические вещества, лекарства, вредные вещества в воздухе.
Особенностью эндотелиального слоя является его неспособность ни к регенерации, ни к делению. В результате потери эндотелиальных клеток, оставшиеся клетки берут на себя повышенную нагрузку, распластываясь, занимают всю свободную площадь. Однако, компенсаторные механизмы имеют свои пределы, поэтому с прогрессированием патологического процесса отмечается помутнение роговицы, её отек и значительное снижение остроты зрения.
При рождении плотность эндотелиальных клеток колеблется от 3500 до 4000 кл/мм2, во взрослом состоянии плотность их снижается до 2500 – 1400 кл/мм2. При концентрации эндотелиальных клеток до 1000 на 1 мм2 роговица человека сохраняется свою прозрачность, а при 400-700 кл/мм2 сохранение эндотелиального пласта возможно, однако трофика роговицы страдает, что приводит к ее помутнению.
2497 клеток/мм2 509 клеток/мм2
(Норма) (критическое снижение)
Четкое изображение эндотелия и возможность определить плотность клеток на единицу площади, их средний размер дает эндотелиальная микроскопия.
В клинике «ВІЗУС» для выполнения снимка роговичного эндотелия используется эндотелиальный микроскоп TOPCON SP-3000P.
Измерение количества эндотелиальных клеток и толщины роговицы стало как никогда проще, удобнее для врача и комфортнее для пациента.
Инструмент автоматически подсчитывает количество клеток эндотелия на единицу площади роговицы и определяет вариабельность формы и размеров клеток.
Основные качества диагностического прибора, на котором проводится обследование:
- Неинвазивный способ просмотра и получения изображения эндотелиального слоя роговицы человека in vivo
- Высокая разрешающая способность
- Быстрота обследования (занимает всего несколько секунд)
- Достоверность показателей
- Бесконтактный метод обследования (при измерении прибор не касается поверхности роговицы, что устраняет опасность попадания в глаза инфекции или физического повреждения глаза.
- Все исследования абсолютно безболезненны и безвредны.
Эндотелиальная микроскопия роговицы незаменима при диагностике заболеваний роговицы, а также при оценке эндотелия до и после оперативных вмешательств на глазах.
В клинике «ВІЗУС» подсчет эндотелиальных клеток включен в комплекс обязательного предоперационного обследования пациентов с катарактой, что позволяет выработать оптимальную хирургическую тактику перед операцией, для предотвращения эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы. В клиниках, где не производится данный подсчет клеток, существует более высокий риск послеоперационных осложнений.
Источник
Актуальность
Задний эпителий (эндотелий) роговицы человека представлен монослоем клеток гексагональной формы, расположенных на внутренней поверхности роговицы. Он играет важнейшую роль в реализации гидробаланса роговицы, регулируя приток водянистой влаги к строме, обеспечивая тем самым ее прозрачность [1]. При этом потенциал обновления клеток эндотелия роговицы ограничен естественными механизмами, и восстановление целостности монослоя возможно преимущественно за счет клеточной миграции и растяжения клеток [4, 9]. Это обусловливает тот факт, что в случае значительного повреждения эндотелиального слоя роговицы у человека при различных условиях формируется дисфункция слоя, отек стромы и, как следствие, утрата прозрачности роговицы. На текущий момент основными способами лечения дисфункции эндотелия роговицы человека являются сквозная кератопластика (СКП) и селективные трансплантации эндотелиального слоя: (эндотелиальная кератопластика с удалением Десцеметовой мембраны [15], эндотелиальная кератопластика Десцеметовой мембраны [14], перенос донорской Десцеметовой мембраны с эндотелием [7, 13]) [3, 5, 8]. Наличие дефицита донорских роговиц препятствует широкому распространению данных операций. Помимо этого, данные методики, как любые сложные вмешательства, требуют наличия подходящей инфраструктуры и высокой квалификации хирурга для проведения данных операций. Такие операции, даже при выполнении их в оптимальных условиях, сопровождаются возникновением ряда осложнений: отслойки трансплантата, воспаления, вызванного инфицированием, или иммунного отторжения. В связи с этим использование клеточной терапии представляется как вариант решения данной проблемы.
Разработка метода воспроизведения жизнеспособных клеток эндотелия роговицы человека in vitro является важнейшей задачей в экспериментальной офтальмологии на протяжении последних тридцати лет. Трудности в культивировании связаны с блокированием клеточного цикла эндотелиальных клеток роговицы в постмитотической фазе как in vitro, так и in vivo. Имеются данные экспериментов, указывающие на то, что задержка клеток в фазе G1 клеточного цикла связана с контактным торможением и экспрессией трансформирующего фактора роста β, а также нехваткой паракринной стимуляции факторами роста для перехода клеток из фазы G1 в фазу S клеточного цикла [10]. Таким образом, этап выделения при культивировании клеток эндотелия роговицы человека несет в себе задачу не только изолировать клетки и перенести их в ростовую среду, но и простимулировать их деление. Предыдущие попытки стимуляции деления клеток осуществлялись путем механического воздействия или выделения клеток раствором диспазы/трипсина/этилен-диаминтетрауксусной кислоты и показали, что эти методы наряду со стимулированием пролиферации приводят к эпителиально-мезенхимальной транзиции клеток и потере характерного гексагонального клеточного фенотипа [6, 12].
Изменения, происходящие при эпителиально-мезенхимальной транзиции, затрагивают все уровни организации клетки. Первоначально меняется экспрессия ряда генов, что ведет к реорганизации и изменению функционирования внутриклеточных структур с последующими изменениями морфологии клеток и, как следствие, их функциональных свойств [2]. Отсутствие данных о степени выраженности эпителиально-мезенхимальной транзиции и наличие данных об улучшении адгезии клеток к поверхности культивирования являются факторами в пользу изучения методики изоляции клеток данного вида с использованием коллагеназы. Способность дезагрегировать клетки и небольшое количество данных об использовании данного фермента для изоляции клеток эндотелия роговицы человека делают текущий эксперимент актуальным. Помимо этого, использование данной методики культивирования видится актуальным ввиду различия сред, используемых в опытах, описанных в литературе.
Цель
Разработать ферментативный метод выделения клеток эндотелия роговицы из кадаверных глаз человека.
Материал и методы
В исследовании использовались корнеосклеральные диски, считающиеся непригодными для использования при трансплантации роговицы. Корнеосклеральные диски были выделены из 4 глаз 2 трупов доноров 57 и 63 лет и предоставлены Глазным тканевым банком «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. Комплекс клеток эндотелия роговицы человека с Десцеметовой мембраной был выделен из склерально-роговичных фрагментов при помощи скальпеля и пинцета под микроскопом с отступом 2 мм от линии Швальбе. Образцы случайным образом разделили на две группы. В первой – “комплекс” подвергали ферментативной дезагрегации в растворе коллагеназы типа (2 мг/мл) в среде DMEM/F12, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки в течение 30 минут при 37°С при постоянном помешивании. Отмытую суспензию переносили в чашки Петри 35 мм (SPL). В качестве контроля образцы второй группы помещали в чашки Петри 35 мм (SPL) без обработки. Культивирование в обеих группах проводилось в среде с добавлением DMEM F12/199 = 1:1, 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% раствора антибиотиков, L-глютамина – 6 ммоль/мл, фактора роста фибробластов – 10 нг/мл, гепарина, фактора роста эндотелия – 5 нг/мл, при стандартных условиях. Смену среды проводили каждые 2 суток. При достижении монослоем клеток 80-90% конфлуэнтности осуществляли пассирование культуры c использованием раствора трипсина. Плотность клеток при рассеве составляла не менее 300000 кл/мл. Подсчет клеток при пассировании культуры производили с использованием камеры Горяева. Фазово-контрастный контроль и подсчет количества клеток в ходе культивирования осуществлялся на инвертированном микроскопе «ix81 Olympus». Изучались процессы поведения клеток эндотелия на сроках культивирования до 2 месяцев, а также их эпителиально-мезенхимальная пластичность.
Выводы
Группа клеток, претерпевших ферментативное воздействие в ходе культивирования, отличалась высокой скоростью адгезии к стандартной культуральной поверхности в сравнении с контрольной группой. Данный факт, вероятно, связан со способностью коллагеназы селективно расщеплять интерстициальный коллаген, не воздействуя на коллаген, находящийся в составе базальной мембраны.
Клетки, обработанные коллагеназой 1 типа, формируют агрегаты, сохраняя при этом межклеточные связи, представленные белком ZO-1 и коннексином-43, что делает перспективным использование для культивирования планшетов, покрытых коллагеном 4 типа, ламинином 5 типа и перлеканом (рис. 1б).
Популяция клеток эндотелия роговицы, выделенная ферментативно, характеризуется большей плотностью роста клеток в ростовой среде. В этой же популяции спустя 2 месяца культивирования количество плоских гексагональных клеток в поле зрения составляло 92,7±6,5%, тогда как в контрольных образцах недостоверно меньше 88±6% (рис. 1в).
Разница между контрольной и опытной группами подтверждает необходимость стимуляции деления клеток при культивировании клеток эндотелия роговицы человека. Достижение лучшего результата, предположительно, связано со способностью коллагеназы ликвидировать митотический блок, возникающий вследствие контактного торможения (рис. 1а, в).
Альтернативные методы стимуляции деления клеток, описанные в литературе, основывались на механическом разобщении клеток, что в присутствии факторов роста наряду со стимуляцией пролиферации стимулировало эпителиально-мезенхимальную транзицию. Данный факт делает затруднительным выделение клеток по вышеописанному методу ввиду широкого распространения использования фактора роста фибробластов β как митогена в ростовой среде. Помимо механического воздействия, исследователи использовали диспазу/трипсин/этилендиаминтетрауксусную кислоту, что, как оказалось при дальнейших исследованиях, может служить триггером для эпителиально-мезенхимальной транзиции и потери характерного гексагонального клеточного фенотипа [6, 12]. Эпителиально-мезенхимальный переход в культурах отмечался по достижению конфлюентности 70-80% в контроле и 90% в группе ферментативной дезагрегации. Как показали исследования, эпителиально-мезенхимальная транзиция инициируется пролиферацией как результат активации канонического сигнального пути Wnt в присутствии эндотелиального фактора роста и/или фактора роста фибробластов β. Данная транзиция принимает необратимый характер с прерыванием пролиферации, когда TGF-β1 выступает в роли триггера для канонического TGF-β сигнального пути с исходом в ядерную транслокацию pSmad2/3 и Zeb1/2 [11]. Так как исходом этих процессов является потеря нормального фенотипа клетками эндотелия роговицы человека, клеточно-инженерная стратегия для клеток данного вида должна быть направлена, в том числе, на избежание активации канонического Wnt-Smad2/3-Zeb1/2 сигнального пути. Перспективным способом для решения данной задачи видится добавление блокатора TGF-β сигнального пути в ростовую среду.
Ферментативное выделение клеток эндотелия роговицы человека раствором коллагеназы 1 типа является более эффективным методом в сравнении с классической методикой пассивной миграции клеток с Десцеметовой мембраны.
На эпителиально-мезенхимальный переход в культуре оказывает влияние способ выделения клеток эндотелия роговицы человека.
Необходим поиск агентов биологического действия, способствующих снижению скорости и объема эпителиально-мезенхимального перехода.
Методика культивирования клеток эндотелия роговицы человека с этапом ферментативной обработки может быть усовершенствована: целесообразно изучение влияния биопокрытия культуральной поверхности, а также выявление изменений при культивировании клеток в среде с добавлением блокатора сигнального пути Wnt с целью снижения проявления эпителиально-мезенхимальной транзиции.
Источник
Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Текущая версия страницы пока не проверялась опытными участниками и может значительно отличаться от версии, проверенной 20 июля 2019;
проверки требуют 3 правки.
Перейти к навигации
Перейти к поиску
| Эндотелий роговицы | |
|---|---|
| лат. epithelium posterius corneae | |
| Роговица человека. 1. эпителий роговицы 2. Боуменова мембрана 3. строма роговицы 4. Десцеметова оболочка 5. эндотелий роговицы | |
| Каталоги | |
| |
| Медиафайлы на Викискладе |
Эндотелий роговицы, задний эпителий роговицы — монослой специализированных плоских клеток, выстилающих заднюю поверхность роговицы и входящих в соприкосновение с содержимым передней камеры глаза. Гексагональные клетки эндотелия содержат повышенное количество митохондрий и осуществляют транспорт жидкости и растворенных веществ, поддерживая роговицу в слабо дегидрированном состоянии, необходимом для её прозрачности. Площадь клеток примерно одинакова; при значительном разбросе их размера говорят о наличии полимегетизма.
Заболевания и повреждения[править | править код]
- Эндотелиальная дистрофия Фукса
- X-связанная эндотелиальная дистрофия роговицы
- Задняя полиморфная дистрофия роговицы
- Врожденная Наследственная Эндотелиальная Дистрофия 1 (CHED1)
- Врожденная Наследственная Эндотелиальная Дистрофия 2 (CHED2)
Задняя полиморфная дистрофия роговицы: преобразование эндотелия (под десцеметовой мембраной, выделенной ярко-красным) в слоистый чешуйчатый эпителий. Из обзора Klintworth, 2009.[1]
Изображение гексагональных клеток эндотелия роговицы при световой микроскопии в отражённом свете
Примечания[править | править код]
- ↑ Klintworth G. K. Corneal dystrophies (англ.) // Orphanet Journal of Rare Diseases (англ.)русск.. — 2009. — Vol. 4. — P. 7. — doi:10.1186/1750-1172-4-7. — PMID 19236704.
Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=Эндотелий_роговицы&oldid=101631439
Категории:
- Глаз
- Офтальмология
Источник
