Методы консервации донорской роговицы

Актуальность проблемы

Проблема трупного тканевого донорства и трансплантации роговицы является одним из наиболее сложных и актуальных аспектов офтальмологии [1, 3, 5, 6, 8, 14, 21, 32, 35, 38].

Для прозрачного приживления сквозного трансплантата роговицы необходима максимальная сохранность жизнеспособности эндотелиальных клеток (ЭК), обеспечивающих нормальную гидратацию и прозрачность посредством транспортной и насосной функций [6, 35]. ЭК роговицы являются высокодифференцированными и относятся к нейроглии [2, 11, 12, 17, 30].

После сквозной трансплантации роговицы ЭК не способны к митотической регенерации, при их значительной потере в посттрансплантационном периоде возникает сначала функциональная декомпенсация роговицы, затем необратимое помутнение трансплантата [6, 35].

В этой связи сквозную трансплантацию роговицы принято называть искусством пересадки одного клеточного слоя [6].

Выкраивание и фиксация роговичного трансплантата при сквозной и задней послойной кератопластиках сопровождаются потерей ЭК, в связи с чем исходная ПЭК должна быть не менее 2800-3000 кл/мм² [38]. Однако уже на этапе консервации в ЭК трупных донорских роговиц возникает ряд морфо-функциональных перестроек, сопровождающихся десквамацией ЭК и снижением их жизнеспособности [28, 35].

В этой связи повышение жизнеспособности и стабилизация плотности ЭК трупных донорских роговиц на этапе их консервации является крайне важной и актуальной задачей [1].

Преимущества и недостатки традиционных методов консервации роговицы Гипотермическая консервация роговиц в жидких средах.

В 1974 г. E. McCarey и H.E. Kaufman предложили принципиально новый метод гипотермической консервации донорских роговиц для сквозной кератопластики, основанный на использовании питательной среды 199, высокомолекулярного декстрана, фосфатного буфера, индикатора рН и антибиотиков [37]. Было показано, что роговицы кроликов, консервированные в этой среде при +4°С, сохраняют свою жизнеспособность до 14 дней. Однако дальнейшими исследованиями D.S. Hull и соавт. было установлено, что консервация кроличьих роговиц в среде МакКери-Кауфмана уже на 2-3 сут. приводит к значительному отеку стромы, а к 7 сут. — к полной потере жизнеспособности ЭК и значительному снижению их плотности [29].

В 1985 г. H.E. Kaufman и соавт. предложили новый состав жидкой среды для консервации роговицы — К-Sol [33]. Морфологическими исследованиями была выявлена полная ультраструктурная сохранность ЭК трупных донорских роговиц до 10 сут. гипотермической консервации, при этом их функциональная активность и жизнеспособность к 3-4 сут. отсутствовали [20, 26].

Немногим позже разработанные в США среды Dexsol и Optisol, а в Европе — Eusol широко применяются в Глазных банках всего мира и также позволяют сохранять жизнеспособность и пороговую плотность ЭК при гипотермической консервации роговиц до 4 сут. [34, 39].

В 1990 г. впервые в России был предложен состав отечественной среды для консервации роговицы (пропись Борзенка-Мороз), отличающийся от выше перечисленных сред адекватным подбором аминокислотного состава, содержанием энергетически значимого субстрата — натрия ?-оксибутирата, оказывающим выраженное защитное действие на ЭК, обеспечивающим стабилизацию клеточных мембран, сохранность макроэргических соединений и стабильность ПЭК по крайней мере до 6 сут. [1]. В настоящее время среда Борзенка-Мороз применяется во всех Глазных банках и лабораториях консервации роговиц Российской Федерации.

Недостатки метода гипотермической консервации донорских тканей и органов в жидких средах всегда побуждали исследователей к поиску альтернативных гипотермии физических (нормотермических), биохимических и фармакологических методов защиты трансплантата [15].

Консервация роговиц методом органного культивирования D.J. Doughman и соавт. [24, 25] детально разработали, экспериментально доказали и предложили для клинического применения технику консервации донорских роговиц для сквозной кератопластики при +34°С до 33 сут., которую назвали методом органного культивирования. S. Sperling и соавт. [41] трансплантировали роговицы, консервированные этим методом, и получили обнадеживающие результаты. Однако W.M. Bourne и соавт. [21] позже установили, что в отдаленном посттрансплантационном периоде потеря ЭК роговиц, консервированных методом органного культивирования, была значительно выше, чем потеря ЭК роговиц, консервированных при гипотермии в жидких средах.

Тем не менее, в силу ряда неоспоримых достоинств метод органного культивирования был признан альтернативным гипотермической консервации донорских роговиц в жидких средах [21]. Основным достоинством этого метода является так называемая «Восьмидневная система профилактики контаминации», обеспечивающая скрининг потенциально контаминированного донорского материала и устранение риска развития посттрансплантационного эндофтальмита. В настоящее время в связи с финансовыми и значительными трудозатратами этот метод консервации донорских роговиц применяется только в некоторых Глазных банках Европы.

Криогенная консервация донорских роговиц В настоящее время консервация клеток и тканей в жидком азоте при -193°С широко применяется в биологии и некоторых областях медицины. Метод криоконсервации позволяет сохранять клетки и ткани в жизнеспособном состоянии практически бессрочно. К сожалению, попытки многих исследователей [16, 18, 32] детально разработать программу пошагового замораживания трупных донорских роговиц, подобрать оптимальные вне- и внутриклеточные протекторы и их концентрации для холодовой защиты ЭК с последующим хранением в жидком азоте пока не дали положительных результатов в клинике [23].

Прежде всего, это связано с образованием множественных отверстий в цитоплазматических мембранах ЭК и значительной их потерей после размораживания — 1133% [3, 4, 9].

В настоящее время метод криогенной консервации донорских роговиц находится на стадии поиска принципиально новых методологических подходов [22].

Пролонгирование витальных свойств эндотелиальных клеток донорских роговиц с помощью регуляторных пептидов В ряде работ была показана принципиальная возможность стимулировать миграцию ЭК, митотическую активность и синтез ДНК с помощью эпидермального фактора роста (EFG), фактора роста фибробластов (FGF), трансформирующего ростового фактора ? (TGF-?), тромбоцитарного фактора роста (PGF), инсулиноподобного фактора роста -1 (IGF-1), а также путем комбинации их с фетальной бычьей сывороткой, трансферином, гепарином, 3′,5′-циклическим монофосфатом, селеном [36, 43, 44, 45]. При этом наиболее выраженный эффект оказывали FGF и EFG. В 2009 г. Y.J. Shin с соавт. опубликовали результаты исследований о защитном действии Кластерина (полипептида, регулирующего апоптоз) на ЭК роговицы [40]. По их мнению, применение этого регуляторного белка предотвращает апоптоз клеток, вызванный окислительным стрессом.

Одним из ключевых свойств цитоплазматических регуляторных пептидов, определяющих их эффективность, является эффект «наведения» или органного тропизма, гомологичности [19]. При этом меченые радионуклидами регуляторные пептиды, введенные животным подкожно, кумулируются в тех тканях и органах, из которых они были выделены.

В основе реализации этого эффекта лежит органоспецифическая маркировка пептидов в процессе их синтеза в клетке. За то, куда именно будет распределён в клетке вновь синтезированный пептид, отвечает универсальная ZIP-система, обнаруженная во всех эукариотических клетках [19]. В процессе синтеза на рибосомах регуляторный пептид наделяется индивидуальным ZIP-кодом, своего рода почтовым индексом, благодаря которому белок, попав в системный кровоток или лимфу, находит своего адресата — гомологичную ткань или орган, в котором он был синтезирован. Специализированные рецепторы клетки считывают с пептида ZIP-код и определяют его дальнейшие действия в регуляции внутриклеточного гомеостаза и клеточного генома.

Практическая значимость ZIP-системы заключается ещё в том, что большинство регуляторных пептидов не имеют видовой специфичности: цитоплазматические пептиды, выделенные из тканей одного животного, кумулируются и регуляторно влияют на гомологичные ткани и органы другого животного и человека.

В целях восстановления и поддержания структуры и функции ЭК трупных донорских роговиц в процессе их консервации значительный интерес могут представлять фармакологические препараты на основе гомологичных клеточных пептидов, полученные из тканей глаза. К таким препаратам нового поколения относятся цитамины отечественного производства [7, 13] и тканевая панель препаратов NeyDIL импортного производства [10, 27]. К сожалению, отечественная фармакологическая промышленность не производит препаратов регуляторных пептидов с адресным действием к эндотелиальным клеткам роговицы. До настоящего времени единственным органотропным препаратом, полученным из регуляторных пептидов клеточной цитоплазмы эмбриональных роговых оболочек промышленных животных, является препарат NeyDIL Nr.37 «Cornea», который выпускается немецкой фирмой «VitOrgan» и имеющий Государственную регистрацию в Российской Федерации.

Препарат NeyDIL Nr.37 содержит регуляторные пептиды из цитоплазмы клеток фетальных и ювенильных роговиц животных, является основным регенераторным средством для роговицы, улучшающим процессы внутриклеточной репарации, диффузии, осмоса, стимулирующим метаболизм и восстанавливающим цитоархитектонику различных клеток роговицы [10, 42].

Проведенный анализ литературных источников позволяет предполагать высокую эффективность гипотермической консервации донорских роговиц с применением цитоплазматических регуляторных пептидов, которым в последнее время уделяется большое внимание как препаратам-ревитализаторам нового поколения.