Способность роговицы к регенерации

Исследователи университета Ньюкасла, работающие под руководством профессора Чэ Коннона (Che Connon), предложили потенциально революционный метод лечения травм глаза и предотвращения развития слепоты. Он заключается в ферментативном размягчении роговой оболочки глаза, способствующем самообновлению стволовых клеток и регенерации повреждений.

Являющаяся внешним слоем глаза роговая оболочка, или роговица, играет важную роль в фокусировке зрения, однако механизмы, обеспечивающие поддержание ее прозрачности и устойчивости к повреждениям, на сегодняшний день мало изучены. Подобно коже, роговица покрыта многослойным эпителием, который выступает в роли барьера, защищающего внутренние структуры глаза от физических воздействий и микроорганизмов. Однако, в отличие от кожи, при возникновении повреждений эпителий роговой оболочки восстанавливается стволовыми клетками, локализующимися в ее периферических отделах. Сначала эти клетки многократно делятся, после чего мигрируют в зону повреждения уже в виде зрелых эпителиальных клеток. Однако этот процесс заживления может нарушаться в случаях, когда повреждения затрагивают нишу стволовых клеток.

С помощью сложной технологии микроскопирования, позволяющей визуализировать физические свойства тканей с очень высоким разрешением, авторы продемонстрировали, что зона роговой оболочки, населенная стволовыми клетками, намного мягче, чем окружающая ее ткань. При этом оказалось, что нарушение способности ткани к заживлению ран обусловлено не гибелью клеток, а их дифференцировкой и созреванием в ответ на уплотнение ткани, вызываемое повреждением, таким как химический ожог.

Эффект обработки коллагеназой вначале был протестирован на донорских роговицах.

Используя живую ткань роговицы в качестве модельной системы, авторы воспроизвели эффекты химических ожогов. После локальной обработки небольшими дозами коллагеназы – фермента, размягчающего белок коллаген – уплотненная в результате ожога ткань снова становилась мягкой, что возвращало ей способность поддерживать стволовые клетки и обеспечивать восстановление повреждений. Применяемый в рамках исследования препарат коллагеназы уже получил одобрение Управления по контролю за продуктами и лекарствами США и Европейского агентства по лекарственным средствам для применения в схожих терапевтических целях.

Сравнение обработанных коллагеназой и не получивших лечения после химического ожога роговых оболочек кроликов.

Авторы считают, что предложенная ими методика позволит значительно уменьшить дефицит донорских роговиц для трансплантации пациентам с полной слепотой, вызванной рубцеванием роговой оболочки глаза в результате перенесенных ожогов, механических повреждений или заболеваний. Более того, по оценкам специалистов, 10 миллионам человек в мире требуется операция для предотвращения слепоты, вызванной болезнями, такими как трахома – инфекционное заболевание глаза, часто поражающее людей в развивающихся странах.

Статья Ricardo M. Gouveia et al. Assessment of corneal substrate biomechanics and its effect on epithelial stem cell maintenance and differentiation опубликована в журнале Nature Communications.

Евгения Рябцева, портал «Вечная молодость» https://vechnayamolodost.ru по материалам Newcastle University: A soft spot for stem cells helps cornea healing.

Регенерация роговицы при травматических повреждениях переднего отрезка глаза является основополагающим фактором в восстановлении зрения у пациентов. Особую важность представляет изучение репаративных процессов в роговице после химических ожогов, так как в результате ожога нарушается не только ее структура, но и метаболизм. В связи с особенностями кровотока области лимба в зоне ожога быстро накапливаются токсические продукты, что еще более усугубляет патологический процесс [3-5, 7]. Патогенетически направленное лечение должно проводиться с целью восстановления оптических свойств роговицы, подавления аутоиммунных реакций, предупреждения избыточной васкуляризации, конъюнктивальных сращений, иритов, иридоциклитов, вторичной глаукомы и катаракты [2, 6, 9].

    Механизмы патологического процесса и реакций организма при ожогах глаз настолько сложны и разнообразны, что применяемые средства терапии далеко не всегда купируют развитие активного ожогового процесса [8]. Установлено, что растворы щелочей, омыляя жиры и жироподобные вещества клеточных мембран, проникают в тело клетки, изменяя рН клеточного вещества, приводят к растворению (колликвации) белков, разрушают клетку и проникают глубоко в ткани [2, 4, 5, 11].

    Щелочной ожог роговицы вызывает дестабилизацию уровня гликозаминогликанов оптических сред глаза и сыворотки крови, выражающуюся в изменении их фракционного состава, при этом наблюдается активация реакций глюкуронидной конъюгации в тканях органа зрения, наиболее выраженная в переднем отрезке глаза [9]. Иной механизм воздействия оказывают растворы кислот, вызывая некроз конъюнктивы и роговицы с коагуляцией белков, что предотвращает распространение детергента вглубь тканей [2, 8, 11].

    При ожоговой болезни глаз нередко происходит отторжение и некроз трансплантата вследствие нарушения микроциркуляции собственной поврежденной ткани, развития в организме иммунологического конфликта, формирования васкуляризованных бельм [3-5, 10].

    Следовательно, разработка медикаментозных и хирургических методов оптимизации репаративной регенерации роговицы после химических ожогов является одним из факторов успешного лечения данной патологии.

    Цель

Оценка течения процессов репаративной регенерации роговицы при применении биопластического материала – наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты на модели химического (щелочного и кислотного) ожога роговицы.

    Материал и методы

    Наноструктурированный биопластический материал «Гиаматрикс» представляет собой биополимер гиалуроновой кислоты в виде плёнки толщиной 0,3-0,5 мм (рис. 1, 2). Он разработан в научно-производственной лаборатории клеточных технологий Оренбургского государственного университета и предназначен для восстановления дефектов кожных покровов [1], разрешен к применению в общей и пластической хирургии (регистрационное удостоверение ФСР 2011/10313 от 18.03.2011 г.).

    Экспериментальное моделирование химического ожога роговицы проведено на 36 кроликах (72 глаз).

    В первой серии эксперимента на 36 глазах 18 экспериментальных животных моделировали щелочной ожог роговицы. После чего животных разделили на две группы: опытную (18 правых глаз) и контрольную (18 левых глаз).

    В опытной группе проводили аппликацию биопластического материала «Гиаматрикс» по оригинально разработанной методике (Патент на изобретение № 2485919 от 12.04.2012 г.). После стандартной обработки операционного поля, проведения эпибульбарной анестезии (Sol. Inocaini 0,4% 3-кратно), веки фиксировали векорасширителем.

Предварительно из биоматериала

    «Гиаматрикс» трепаном выкраивали диск диаметром 10 мм. Затем «Гиаматрикс» укладывали на поверхность роговицы, смачивали физиологическим раствором для улучшения эластических свойств биоматериала и накрывали мягкой контактной линзой, которую фиксировали двумя перекидными швами.

    В контрольной группе закладывали глазной гель Солкосерил. В обеих группах проводили инстилляции 0,3%-ного раствора Ципромеда.

    Во второй серии формировали кислотный ожог роговицы средней степени тяжести (18 кроликов, 36 глаз). Далее в опытной группе проводили аппликацию биопластического материала по описанной выше методике (18 глаз), а в контрольной группе – закладывание глазного геля Солкосерил (18 глаз).

    Клиническое исследование включало биомикроскопию переднего отрезка глаз с динамической оценкой состояния конъюнктивы, роговицы и глубже лежащих сред; флуоресцеиновую пробу.

    На сроках 3, 7, 14, 30 и 90 суток животных выводили из эксперимента методом передозировки наркоза (3-разовых доз хлороформа).

    Для проведения светооптического и иммуноцитохимического исследований энуклеированные глазные яблоки фиксировали в растворе нейтрального формалина, подвергали макромикроскопическому препарированию, затем промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин, выполняли серии меридиональных гистологических срезов с применением окраски гематоксилин-эозином. Изучение ультратонких срезов и их фотографирование проводили на электронном микроскопе ЭМВ 100АК при увеличении от ?8000 до ?40000.

    Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные антитела с целью обнаружения клеток экспрессии белков р53 и bcl2, участвующих в инициации апоптоза и выявлении интернуклеосомальной фрагментации ДНК. Во всех случаях подсчитывали процент окрашенных клеток в случайно выбранных полях зрения.

Результаты

    Щелочной ожог сопровождался признаками роговичного синдрома: блефароспазмом, светобоязнью, слезотечением. Клиническое исследование показало, что воздействие 2,5%-ного раствора гидрооксида натрия приводило к формированию эрозии роговицы в виде круга диаметром до 7 мм, что сопровождалось признаками реактивного воспаления: отеком и инъекцией конъюнктивы. Применение биопластического материала «Гиаматрикс» способствовало эпителизации раневого дефекта у всех животных опытной группы к 4 суткам (рис. 3), на сроке 7 суток в области воздействия щелочи отмечали нежное поверхностное помутнения (рис. 4), в то время как в контрольной группе дефект сохранялся до 7 суток. Так же было отмечено, что признаки асептического воспаления в опытной группе проходили на трое суток раньше, чем в контрольной группе.

    Морфологически в зоне роговицы, подверженной действию щелочи, отмечали гибель и десквамацию клеток переднего эпителия роговицы, фрагментацию и исчезновение клеток стромы. Исследование конъюнктивы показало, что ток крови резко замедлялся, в мелких сосудах формировались тромбы, плазма выходила в окружающие ткани, что сопровождалось резким отеком конъюнктивы. Следует отметить, что характер морфологических изменений тканей глаза в условиях некроза, вызванного химической травмой, был сходным (относительно воздействия кислот и щелочей).

    Существенным являлось то обстоятельство, что по мере усиления эрозивного процесса (поздние сроки наблюдений) в живых (сохранных в гистологическом отношении тканях), прилежащих к некротизированным, возникало выраженное реактивное воспаление. Оно характеризовалось вазодилатацией кровеносных сосудов, экстравазацией плазмы и форменных элементов крови с формированием демаркационной зоны (рис. 5).

    Анализ серийных гистологических препаратов показал, что демаркационная линия в исследованных участках глаза была выражена слабо, а в лимбальной зоне она отсутствовала. Это приводило к утяжелению и прогрессированию некротических процессов эпителиальных и соединительнотканных структур.

    В переднем эпителии роговицы и эпителии слизистой оболочки конъюнктивы отмечались грубые повреждения, завершающиеся десквамацией эпителиоцитов и обнажением базальной мембраны. Одновременно усиливалась секреция слизь-продуцирующих элементов (бокаловидные клетки конъюнктивального эпителия) (рис. 6).

    При этом альтерация тканей роговицы не сопровождалась адекватными экссудативной (сосудистой) и продуктивной (пролиферативной) реакциями, что свидетельствовало о сохранении дистрофических процессов в моделируемых условиях. Таким образом, фокус воспаления в связи с процессами экссудации не в полной мере выполняет дренажную и элиминативную функции при ожоговой травме роговицы.

    Преобладающее большинство эмигрирующих лейкоцитов составили сегментоядерные нейтрофилы. Помимо них, значительно реже экстравазации подвергались лимфоциты, моноциты, базофильные гранулоциты и эозинофилы. Данные клетки продвигались в зону повреждения роговицы между волокнистыми структурами по направлению к центру воспаления, где и наблюдалось их наибольшее скопление (рис. 7).

    В области повреждения роговицы и прилежащих участков конъюнктивы, по мере угасания воспалительного процесса, происходила активизация камбиальных клеток и клеток фибробластического дифферона (рис. 8). При этом образовывались волокнистые структуры без разрастаний эпителиальной ткани.

    Исследование показало, что травматическое (химическое) повреждение роговицы экспериментальных животных приводило к развитию некротического воспаления. Исход альтеративного воспаления зависел от глубины поражения и повреждения тканей глаза (по срокам наблюдений) и, как правило, заканчивался рубцеванием посттравматического дефекта.

Морфологические исследования, проведенные на различных сроках эксперимента, позволили устано-вить последовательность процессов, протекающих от момента нанесения химического ожога роговицы до завершения ее восстановления, которые были различными в опытной и контрольной группах.

    Воздействие кислоты (3%-ный раствор уксусной кислоты) на неизмененную роговицу приводило к поверхностному помутнению (рис. 9), но инстилляция 0,1%-ного раствора флюоресцеина натрия показала, что ткань стромы не прокрашивалась, а следовательно эпителиальный покров был сохранен (рис. 10). Однако гистологически выявляли коагуляционный некроз эпителия без отторжения уплотненного струпа. В процессе лечения некротизированные ткани отторгались и на более поздних сроках исследования флуоресцеиновая проба становилась положительной. Клинически было показано, что применение «Гиаматрикса» способствовало более раннему уменьшению отека роговицы и признаков реактивного воспаления по сравнению с контрольной группой, помутнение в опытной группе рассасывалось к 14 суткам, в то время как в контроле – к 30 суткам.

    Морфологическое исследование глаз на сроке 3-х суток как опытной, так и контрольной групп пока зало, что клетки переднего эпителия роговицы были повреждены; в мелких сосудах конъюнктивы формировались тромбы. Кроме деструктивных изменений эпителиоцитов, отмечались нарушения в строме, которые строго соответствовали участку ожога и захватывали не менее 1/3 толщины стромы. В период с 7 по 14 сутки в опытной группе уже наблюдали переход экссудативной фазы воспаления в пролиферативную, в контрольной группе этот процесс был выявлен только к концу месяца.

    Иммуноцитохимическое исследование показало, что при применении биопластического материала снижалась апоптотическая доминанта эпителиоцитов и фибробластов роговицы, взятой для исследования на третьи и четырнадцатые сутки эксперимента. С другой стороны, возрастала экспрессия синтеза протеина bcl2, что свидетельствовало о выраженности пролиферативной фазы воспаления, это подтверждало результаты световой микроскопии. Таким образом, иммуноцитохимическое исследование показало, что аппликация «Гиаматрикса» оптимизировала репаративные гистогенезы с включением механизмов лимитирования экспрессии проапоптатического гена p53, уменьшение иммунопозитивных эпителиоцитов в 2,5-3 раза по сравнению с контрольной группой

    Выводы

    Аппликация биопластического материала на роговицу на начальных этапах лечения повреждений роговицы (щелочной и кислотный ожог) уменьшает выраженность отека и гиперемии и, как следствие, сокращает экссудативную фазу воспаления.

    В результате клинико-функционального анализа особенностей течения щелочного повреждения роговицы установлено, что применение «Гиаматрикса» ускоряет закрытие дефекта роговицы в 1,5 раза быстрее по сравнению с контрольной группой.

    Применением биоматериала в исходе кислотного ожога за счет сокращения экссудативной фазы воспаления ускоряет рассасывание помутнений роговицы по сравнению с применением глазного геля Солкосерил.