Соскоб с роговицы для анализа

Применение методов лабораторной диагностики инфекционных заболеваний глаз порой является единственным и незаменимым способом определения, а иногда и подтверждения этиологии заболевания. Поэтому одним из важных методов диагностики и тактики лечения в работе практикующего офтальмолога является использование основных методов и принципов лабораторной диагностики, а также наличие практических навыков забора клинического материала, направляемого на исследование в клиникобактериологические лаборатории ЛПУ.

ЭТИОЛОГИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ВОСПАЛЕНИЙ ГЛАЗ

Возбудителями глазных инфекций являются вирусы, бактерии, грибы и простейшие. В таблице 1 приведен список наиболее частых возбудителей, которые вызывают инфекционно-воспалительные поражения век, слезоотводящих путей, конъюнктивы, роговицы, сосудистой оболочки, стекловидного тела, сетчатки, диска зрительного нерва и глазницы.

I. ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Использование методов лабораторной диагностики имеет большое значение для подтверждения этиопатогенеза вирусных заболеваний глаз, дифференциации активной и хронической фаз инфекции, а также выбора наиболее эффективного метода лечения.

Лабораторная диагностика вирусных заболеваний глаз основана на использовании прямых и непрямых методов исследований материала, полученного путем соскобов с поверхности роговицы и конъюнктивы, а также содержимого передней камеры.

ПРЯМЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Прямые методы позволяют обнаружить вирус, вирусный антиген или вирусную нуклеиновую кислоту непосредственно в клиническом материале, то есть являются наиболее быстрыми (2–24 ч). Однако из-за ряда особенностей вирусов прямые методы имеют свои ограничения (возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов). Поэтому они часто требуют подтверждения непрямыми методами.

Электронная микроскопия. Электронная микроскопия была предложена как быстрый диагностический метод для обнаружения вирусов без их типирования. Этот метод рекомендуется для диагностики герпетических заболеваний глаз. Вариантом электронной микроскопии является иммунная электронная микроскопия, при которой применяются специфические антитела к вирусам.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Это метод наиболее быстрой диагностики и основан на использовании антител, связанных с флюорохромом. При обработке препарата флюорохромом акридиновым-оранжевым ДНК вируса светится ярко-зеленым цветом, а РНК — рубиново-красным.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Иммуноферментные методы определения вирусных антигенов в принципе сходны с РИФ, но основываются на метке антител ферментами. Выявляемость герпетического антигена в слезной жидкости больных при проведении ИФА достигает 100%.

Радиоиммунный анализ (РИА). Метод основан на метке антител радиоизотопами, по чувствительности и специфичности равен ИФА.

Молекулярные методы. Классическим методом выявления вирусного генома считался высокоспецифичный метод гибридизации нуклеиновых кислот, в настоящее время все шире используется выделение геномов вируса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Разработан вариант количественной ПЦР, позволяющий определять число копий ДНК. С помощью данного метода можно обнаружить ДНК вируса в слезной жидкости, камерной влаге, стекловидном теле и в тканях глаза, в частности в роговице.

Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но еще по-прежнему применяются. Исследование соскоба с поверхности роговицы имеет диагностическое значение при поверхностных формах герпетического кератита и при метагерпетическом поражении. Обнаружение вируса простого герпеса при глубоких кератитах встречается крайне редко.

Метод Иммуноблота (Westernblot и Line-blot, последний отличается от Westernblot нанесением на мембрану диагностически значимых белков) — тест, позволяющий раздельно определять IgM, IgG к отдельным антигенам (белкам возбудителей оппортунистических инфекций), следить в динамике за сменой белков в сыворотке крови и (или) слезной жидкости. Этот метод можно использовать в диагностике ЦМВ-инфекции, ВЭБ-инфекции, ВПГ-инфекции, хламидийной инфекции, токсоплазмоза.

Экспресс-диагностика проводится с помощью RPS Аденодетектора на основе качественного анализа аденовирусных антигенов — гексон-протеинов в слезной жидкости. Действие RPS Аденодетектора базируется на принципе латеральной проточной иммунохроматографии. Избирательность: все известные серотипы аденовируса. Для анализа требуется до 10 мкл слезной жидкости. Продолжительность анализа — 10 минут. Чувствительность теста составляет 89%, его специфичность — 94%. Исследование возможно в кабинете офтальмолога без лабораторного оборудования.

НЕПРЯМЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

Выделение вирусов — один из самых старых и трудоемких методов диагностики. Для успешного выделения вирусов клинический материал должен быть взят в наиболее ранние сроки, что с практической точки зрения бывает невозможно. Серологическая диагностика, основанная на реакции «антиген — антитело», может быть использована для определения как тех, так и других. Исследуются парные сыворотки крови, собранные с интервалом в две-три недели. Положительной реакция считается, по крайней мере, при четырехкратном нарастании титра антител. Серологические методы имеют диагностическое значение при первичном герпесе и для диагностики рецидивирующего герпеса.

Моноклональные антитела. Высокоспецифичный и чувствительный метод определения вирусных антигенов, возникший с развитием генно-инженерных исследований.

II. ДИАГНОСТИКА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Метод бактериоскопической диагностики. Микроскопия патологического материала является первым этапом микробиологического обследования больных с воспалительными заболеваниями глаз. Его задачей является раннее обнаружение возбудителя. Метод основывается на прямом выявлении микроорганизмов на слизистой оболочке глаза с помощью различных приемов микроскопии. Для этого используются различные красители (основные и кислые). Способы окрашивания препаратов бывают простые (ориентировочные) и сложные (дифференциальные).

Культуральный метод (микробиологическое исследование).

Материал для исследования берут с помощью стерильных ватных тампонов, одноразовых и многоразовых микробиологических петель и сразу же высеивают на питательные среды. В течение трех часов материал передают в бактериологическую лабораторию.

Выделение и идентификация микроорганизмов от больных с инфекционно-воспалительными поражениями глаз. Определение антибиотикочувствительности. Для выделения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов наиболее часто в офтальмологической практике применяют жидкую питательную среду — тиогликолиевый бульон, а из плотных питательных сред — кровяной агар, желточно-солевой агар, шоколадный агар и агар Сабуро.

Наиболее частым методом определения антибиотикочувствительности возбудителей заболеваний является диск-диффузионный метод с использованием стандартных дисков, содержащих в них определенное количество антибиотика в мкг. Для определения антибиотикочувствительности за рубежом используют Е-тест, представляющий собой пластиковую полоску c нанесенным градиентом концентрации антибиотика. Этот метод основан на диффузии антибиотиков в агар. Современные лаборатории все чаще оснащаются автоматизированными системами для идентификации и определения антибиотикочувствительности микроорганизмов с использованием готовых тест-систем.

III. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

Лабораторные методы диагностики являются наиболее востребованными при хламидийной инфекции. Это продиктовано стертостью и, порой, неспецифичностью клинической картины заболевания. В настоящее время для диагностики заболеваний хламидийной природы используют бактериоскопический, бактериологический, серологический методы, иммуноферментный анализ антигена, а также ДНК-диагностику.

Бактериоскопические методы предполагают выявление хламидий и их морфологических форм в патологическом материале при помощи различных видов микроскопии. Исследуется соскоб слизистой конъюнктивы. После окраски материала выявляются включения — тельца Провачека — темно-синие, темно-фиолетовые. Однако чувствительность метода составляет всего лишь 15%.

Более перспективна бактериоскопия хламидий методом флюоресцирующих антител (МФА). Чувствительность метода достигает 92-95%, а применение моноклональных антител обусловливает высокую специфичность.

Иммуноморфологические методы. Эти методы основаны на обнаружении антигенных субстанций хламидий в эпителии и других тканях путем обработки препаратов специфическими антителами. Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) предусматривает прямое выявление антигенов хламидий. Непрямой метод иммунофлюоресценции применяют в тех случаях, когда невозможно провести прямой метод.

Культуральный метод. При помощи данного метода можно изолировать возбудитель из материала больного путем заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов и перевиваемых культур клеток. Культуральный метод является достаточно трудоемким и сложным, но и пока единственным, позволяющим дифференцировать жизнеспособные хламидии от погибших в результате лечения, поэтому его целесообразно применять для контроля лечения.

Серологическая диагностика хламидиозов основана на выявлении специфических антител в сыворотке крови. Для серодиагностики используют реакцию связывания комплемента (РСК), реакцию непрямой гемагглютинации (РИГА), микроиммунофлюоресцентный и иммуноферментный анализ (ИФА). Серологические методы диагностики в офтальмологии являются вспомогательными, т.к. у большинства больных антитела не вырабатываются вследствие слабой иммунной активности антигена.

Лигазная цепная реакция (ЛЦР). Чувствительность и специфичность метода составляет 94,7% и 99,8% соответственно по сравнению с культуральным методом.

Метод гибридизации ДНК. Для определения ДНК хламидий часто используют весьма информативный метод точечной гибридизации (дот-гибридизации) нуклеиновых кислот на твердой фазе с использованием ДНК-зонда, меченого биотином. Из исследуемых образцов выделяют суммарную ДНК.

IV. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА АКАНТАМЕБНОГО КЕРАТИТА

Для подтверждения диагноза акантамебного кератита проводят бактериологические и гистохимические исследования. В настоящее время широко применяется ЛЦР для исследования образцов роговичного эпителия и слезной жидкости.

Микроскопическая диагностика. Сбор материала с роговицы и конъюнктивы производится затупленным офтальмологическим скальпелем. Соскоб фиксируется и окрашивается различными методами: окраска по Граму и Романовскому-Гимзе может маскировать акантамебы как лейкоциты, PAS-метод окрашивает стенки цист акантамебы в красный цвет, калькофлюор белый окрашивает стенки амебных цист в ярко-зеленый цвет. Метод окрашивания акридиновым оранжевым применяется для экспресс-диагностики акантамебного кератита.

Гистохимическое исследование. Акантамебы вызывают поверхностные поражения с глубокой инвазией и формированием цист. Поэтому в начале заболевания результаты исследования соскобов с роговицы могут быть отрицательными. В случае отрицательного результата требуется биопсия роговицы для обнаружения акантамеб в глубоких слоях стромы.

Молекулярно-биологический метод. Метод ЛЦР способен обнаружить ДНК акантамебы в образцах роговицы и слезы при минимальном содержании в объеме от 1 до 5 амеб.

Конфокальная микроскопия. Наиболее перспективный метод прижизненной неинвазивной экспресс-диагностики. Метод позволяет увидеть высококонтрастное изображение трофозоитов и цист в срезах роговицы на видеомониторе.

V. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГРИБКОВЫХ ИНФЕКЦИЙ

Микроскопическая диагностика. Соскобы с краев язвы роговицы или с конъюнктивы выполняются после местной анестезии. Исследовать взятые пробы под микроскопом можно в неокрашенных (нативных) и окрашенных препаратах. В окрашенных препаратах элементы гриба выявляются лучше, чем в нативных препаратах. Используя методы микроскопии, можно идентифицировать гифы (нити) грибов, структуру мицелия.

Микологическое исследование. Культуральный метод складывается из выделения культуры гриба при посеве отделяемого из глаза на питательные среды, изучения макро- и микроскопического строения чистой культуры и идентификации гриба. Период ожидания ответа обычно составляет две недели.

Конфокальная микроскопия. Инновационная атравматичная методика, применяемая для сравнения патологического состояния роговицы и ее нормы. С помощью конфокального микроскопа можно оценить гифы, которые имеют различную конфигурацию в зависимости от вида, а также морфологию спор грибов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Данная методика была стандартизована для идентификации грибов. ПЦР весьма перспективна для диагностики грибковых кератитов, чувствительность метода составляет до 74-94%, а специфичность — 55-88%.

Гистологические и гистохимические исследования. Если результаты микологического исследования и микроскопии не дали положительного результата в течение 48-72 часов у пациента с подозрением на наличие грибковой инфекции, рекомендуется провести биопсию роговицы для уточнения диагноза. Гистохимические исследования в 75% случаев могут подтвердить наличие грибов в роговице.