Роговица глаза собаки гистология

Гистология глаз животных – многоэтапный и трудоёмкий процесс, включающий в себя забор материала, его фиксацию, обезвоживание, заливку в парафин, изготовление срезов, окрашивание и, собственно, исследование полученных срезов.

В России единицы занимаются подобным исследованием, однако, несмотря на его сложность, есть ряд случаев, при которых это патоморфологическое исследование незаменимо. Например, в офтальмоонкологии гистология тканей глаза позволяет точно установить вид опухоли, степень её прорастания в окружающие ткани, наличие метастазов и полноту иссечения после хирургического вмешательства.

Кабинет клинической цитологии и компьютерной цитометрии CYTOVET предлагает ветеринарным врачам, столкнувшимся в своей практике с необходимостью гистологии тканей глаз собак, кошек или других животных, свои услуги в проведении данного исследования. Мы следим за современными тенденциями развития данной методики, перенимаем опыт зарубежных коллег и гарантируем качество проведённого исследования. Для уточнения деталей позвоните по телефону 8-921-942-04-00.

Обратите внимание, что по просьбе врачей, которые отправляют глаза на исследование в CYTOVET, мы сделали отдельный бланк направления.

Ниже мы последовательно остановимся на некоторых этапах, чтобы наглядно показать, как проводится гистологическое исследование глаз в нашем кабинете, а также дадим несколько рекомендаций по забору и отправке материала.

Забор материала

Забор материала на гистологию тканей глаза осуществляется путём энуклеации глазного яблока. Эту манипуляцию следует производить аккуратно, чтобы предотвратить отслоение сетчатки и появление всевозможных артефактов в препарате.

Обратите внимание, что удалять глазное яблоко нужно, как можно ближе к стенке орбиты, чтобы в материале присутствовал участок зрительного нерва.

Это нужно для последующего получения срезов с поперечными сечениями зрительного нерва. Нужен участок длиной всего несколько миллиметров, но пренебрежение этим моментом приводит к артефактам или полной невозможности оценить состояние зрительного нерва.

Лишние ткани вокруг глазного яблока надо удалить (включая гардерову железу у грызунов). Это облегчит обзор и препарирование материала, а также предотвратит возможное отслоение сетчатки.

Мы рекомендуем сохранять фрагменты мышечных волокон, чтобы была возможность ориентироваться, где какая сторона, и отличить левое глазное яблоко от правого.

Маркировать глазные яблоки также можно с помощью татуировочных чернил, несмываемой краски, швов и другими доступными способами.

Фиксация глазного яблока

Фиксацию нужно начинать как можно раньше после энуклеации/смерти, что позволит минимизировать аутолиз. Наличие в материале внутриглазных образований, крови, а также большие глазные яблоки, например, у лошадей, требуют более длительной фиксации.

Если взятие материала производилось вне лаборатории, то следует поместить глазные яблоки в формалин и в течение 24 часов доставить на исследование.

На 1 часть объёма глазного яблока нужно 10 частей фиксатора. Использование марли позволяет произвести полную фиксацию на 360 градусов. Нет необходимости в периодических обливаниях материала, поскольку это может привести к противоречивому результату и образованию пространств под пигментным эпителием сетчатки.

В своей работе мы используем 2-6% глутаральдегид, который является хорошим фиксатором для роговицы, хрусталика и сетчатки глаза. Его использование позволяет сохранить форму глазного яблока, что важно для корректной гистологической оценки материала. Фиксация осуществляется методом инъекции.

Метод инъекции

Для введения фиксатора в глазное яблоко следует использовать иглы небольшого размера. Иглу (с присоединённым шприцом) вводят через склеру в стекловидное тело вдоль плоскости длинной задней цилиарной артерии (для не приматов) или под углом примерно 90 градусов к ней (для приматов). Точка ввода должна располагаться позади лимба роговицы в направлении к толстой части глазного яблока, чтобы не повредить хрусталик. Держа глазное яблоко одной рукой, медленно вводят фиксатор в стекловидное тело. Когда появляется ощущение, что глазное яблоко набухает, следует остановиться (примерно 0,15-0,3 мл фиксатора).

Фиксация сетчатки

Для гистологического исследования сетчатки глаза мы используем позаимствованный из гуманной медицины оптимизированный протокол подготовки человеческого глаза для получения качественных образцов сетчатки, разработанный американской лабораторией Cureline.

 1  – произвести разрез глазного яблока с латеральной верхней поверхности;

 2  – отпрепарировать несколько небольших фрагментов стенки глаза и уложить их на подготовительную доску внутренней поверхностью вверх;

 3, 4  – взять бумажный фильтр и сложить его в виде конуса, чтобы получился своеобразный карман;

 5  – два или более фрагмента глазной стенки сложить вместе, наподобие бутерброда;

 6  – поместить фрагменты в полученный из бумажного фильтра карман;

 7  – с помощью скрепки закрыть карман;

 8  – в течение 24 часов фиксировать образцы в 10% буферном растворе формалина с обработкой в гистологическом процессоре.

Перед помещением материала в гистологический парафин бумажный фильтр удаляют.

  (рис. 79)

Глаз фиксируют так же, как для препарата № 73. Переднюю половину глаза заливают в парафин, делают меридиальиые, перпендикулярные роговой оболочке срезы, которые окрашиваются гематоксилином и эозином. На препарате видно место перехода задней стенки глаза в переднюю, называемое углом глаза. Хрусталик и его сумка при приготовлении препарата удаляются.

Этот препарат ознакомит нас со строением всех трех оболочек глаза и с изменениями строения этих оболочек в различных участках глаза.

Наружную оболочку глаза составляет склера, или белковая оболочка, переходящая спереди в прозрачную роговицу (строение роговицы рассматривается в препарате № 71). В области угла многослойный плоский эпителий роговицы переходит в многослойный цилиндрический эпителий конъюнктивы, покрывающий склеру с наружной стороны (иногда конъюнктива на препарате не видна, так как отрывается во время его приготовления). Склера является непосредственным продолжением собственного вещества роговицы. На препарате их легко отличить друг от друга. В собственном веществе роговицы пучки коллагеновых волокон плотно прилегают друг к другу и идут в одном направлении, а основу склеры составляют переплетающиеся между собой пучки коллагеновых волокон, проходящих в разных направлениях. Уже при малом увеличении в склере видны вытянутые черные пигментные клетки. При большом увеличении в цитоплазме их хорошо различаются зерна пигмента. В склере, кроме того, находится небольшое количество кровеносных сосудов.

Средняя оболочка глаза образована сосудистой оболочкой, находящейся под склерой. Она состоит из рыхлой соединительной ткани с большим количеством сосудов и пигментных клеток. В сосудистой оболочке проходят основные пути кровоснабжения глаза. Пигментных клеток здесь много, и они расположены группами и слоями. Таким образом, сосудистая оболочка имеет не только трофическое значение, но и служит экраном для света.

В области угла сосудистая оболочка сильно утолщается и образует ресничное (цилиарное) тело. Продолжением реснич-


Рис. 79. Угол глаза собаки (увеличение ок. 5, об. 3,7):

1 —многослойный эпителий роговицы, 2 -собственное вещество роговицы, 3 — дес- цеметова оболочка, 4 —эндотелий десцеметовой оболочки, 5 — склера, 6 —ресничное тело, 7—радужина, 8 — отростки ресничного тела, 9— зрительная часть сетчатки, ГО—ресничная часть сетчатки, 11 —радужная часть сетчатки, 12 — конъюнктива, 13 —передняя камера глаза, 14 — кровеносный сосуд, 15 —сосудистая оболочка, 16 — пигментные клетки

кого тела служит радужина, представляющая собой перегородку, направленную в полость глаза и отделяющую переднюю камеру глаза от задней.

Основную массу ресничного тела составляет цилиарная мышца. Она состоит из гладких мышечных волокон, идущих в трех направлениях. На препарате видно, что часть мышц идет параллельно склере, часть расходится веерообразно, часть поперечно срезана. Эти мышцы служат для смещения хрусталика и .изменения его кривизны. На внутренней поверхности ресничное тело снабжено выростами различной формы и длины. Выросты вдаются в стекловидное тело, заполняющее всю полость глазного яблока. Ресничное тело выстлано пигментным эпителием, который на препарате имеет вид сплошной черной полосы. Между волокнами цилиарной мышцы и в отростках находится рыхлая соединительная ткань.

Радужина построена из 5 слоев. Со стороны роговицы она покрыта слоем плоских клеток, очень сходных с клетками десне*

метовой оболочки роговицы, от которых они берут начало. Затем идет рыхлая соединительная ткань, образующая 3 слоя: передний пограничный, сосудистый и задний пограничный. В сосудистом слое имеются мышцы. На данном препарате различить эти слои невозможно. Нижний слой радужины состоит из однослойного пигментного эпителия.

Рассмотрим внутреннюю оболочку глаза — сетчатку (препарат № 72). В области ресничного тела и радужины зрительная часть сетчатки теряет свои воспринимающие элементы — палочки и колбочки — и превращается в ресничную часть сетчатки, а затем на поверхности радужины — в радужииную. В ней различают два слоя клеток. Слой, обращенный внутрь к стекловидному телу, состоит из кубических клеток, вероятно, глиального происхождения (из мюллеровских волокон). Слой, соприкасающийся с сосудистой оболочкой, образован пигментными клетками. На препарате этот слой абсолютно черный. В радужной части пигмент содержат оба слоя клеток. 

Орган зрения — периферическая часть, или рецептор зрительного анализатора, воспринимающий световые раздражения.

Вспомогательные приспособления органа зрения, или глаза, выполняют защитную и двигательную функции. Глаза защищают орбиты, ресницы, веки, слезный аппарат (слезные железы, слезный мешок и слезно-носовой проток, открывающийся в носовую полость). По краю век располагаются железы, секрет которых смазывает края век и роговицу. Передняя часть глазного яблока и внутренняя поверхность век покрыты слизистой оболочкой — конъюнктивой, место перехода ее с глаза на веко называют сводом конъюнктивы.

Глазное яблоко развивается из выпячивания боковой оболочки промежуточного мозга, образуя так называемый глазной пузырь. Со стороны эктодермы по направлению к глазному пузырю формируется встречное выпячивание, которое разрастается, округляется и входит в глазной пузырь. Передний расширенный отдел глазного пузыря сближается с эктодермой зародыша. В участке соприкосновения с глазным пузырем эктодерма образует утолщение — хрусталиковую пластинку. В результате этого часть глазного пузыря контактирует с хрусталиковой пластинкой и превращается в двухслойный бокал. Край глазного бокала становится зачатком радужной оболочки и цилиарного тела, наружный слой остальной части — зачатком пигментного эпителия сетчатки, внутренний слой — светочувствительной частью. Клетки хрусталиковой пластинки, обращенные к сетчатке, сильно вытягиваются и превращаются в первичные хрусталиковые волокна, заполняющие полость пузырька. Сосудистая оболочка и склера образуются из мезенхимы, окружающей глазной бокал. Мышцы глазного яблока развиваются из клеточных элементов миотома краниального отдела.

Глазное яблоко обеспечивает зрительную ориентацию благодаря способности воспринимать излучаемый или отражаемый свет от объектов внешнего мира.

К светопреломляющим структурам относят хрусталик, жидкость передней и задней камер, стекловидное тело. Полость глазного яблока заполнена в передней части камерной жидкостью, хрусталиком, стекловидным телом. Хрусталик расположен позади радужки, имеет вид двояковыпуклой линзы, состоящей из плотного ядра и корковой части (сильно вытянутых клеток эпителия), не содержит сосудов и нервов. Между роговицей и хрусталиком находятся глазные камеры: до радужки — передняя, за ней — задняя. Камерная жидкость питает ткани глаза, в которых нет кровеносных сосудов, удаляет продукты обмена, проводит лучи света от роговицы к хрусталику. За хрусталиком расположено стекловидное тело — прозрачная коллоидно-студенистая масса (рис. 64).

Участок выхода зрительного нерва из сетчатки называют слепым пятном сетчатки, или зрительным соском. Вокруг слепого пятна имеется углубление — желтое пятно — участок наилучшего зрительного восприятия, здесь в зрительных клетках имеется желтый пигмент.

В составе глазного яблока различают три оболочки: наружную, или фиброзную; среднюю, или сосудистую; внутреннюю, или сетчатку.

Наружная оболочка состоит из плотной белочной оболочки — склеры и прозрачной оболочки — роговицы, которая является передней частью склеры. Место перехода роговицы в склеру называется лимбом. Роговица воспринимает боль и давление, так как содержит множество нервов, однако кровеносных сосудов не имеет, питание происходит посредством осмоса и диффузии веществ из окружающих сосудов.

Роговица состоит из многослойного плоского эпителия, бесструктурной оболочки — передней пограничной мембраны, соб-

Рис. 64. Схема строения глазного яблока:

/ — роговица; 2— зрачок; 3 — хрусталик; 4 — радужная оболочка; J—белочная оболочка (склера); 6 — собственная сосудистая оболочка; 7—сетчатка; 8—зрительный нерв; 9—мышцы; 10— ресничное тело

Рис. 65. Строение роговицы:

/—многослойный плоский неороговевающий эпителий; 2— Боуменова оболочка; 3 — собственное вещество роговицы; 4 — Десцеметова оболочка; 5 — эндотелиальный слой клеток

ственного вещества роговицы, задней пограничной мембраны и эндотелия (рис. 65).

В многослойном плоском эпителии клетки способны быстро восстанавливаться за счет митотической активности, поверхностные слои клеток, в отличие от эпителия кожи, в норме не ороговс- вают. В эпителии роговицы встречаются многочисленные свободные нервные окончания, придающие особую тактильную чувствительность органу.

Передняя и задняя пограничные мембраны, называемые Боуменова и Десцеметова оболочки, являются базальными мембранами. У разных видов животных их толщина варьирует, например у крупного рогатого скота — 10 мкм, овец — 5…6 мкм.

Собственное вещество роговицы — самая выраженная оболочка, например у коров она достигает 20 мкм. Оболочка образована большим количеством пересекающихся пластинок из соединительной ткани, между которыми находится склеивающее мукоидное вещество. При электронной микроскопии в собственном веществе роговицы выявляют коллагеновые фибриллы, между которыми содержатся уплощенные клетки фибробласты. Эндотелиальный слой располагается на наружной стороне радужной оболочки, обращенной в переднюю камеру глаза. Эндотелий представлен одним слоем многоугольных клеток.

Средняя оболочка, или сосудистая, включает в себя радужную оболочку; цилиарное, или ресничное, тело (средняя часть) и собственно сосудистую оболочку.

Радужная оболочка содержит пигменты, обусловливающие цвет глаз. Радужная оболочка прикрепляется к склере и имеет в центре отверстие — зрачок. Гладкие кольцевые мышцы радужной оболочки суживают зрачок, а радиальные — расширяют.

Ресничное тело представляет собой утолщение сосудистой оболочки, основную часть его образует ресничная мышца. К ресничной мышце прикрепляется хрусталиковая связка, поддерживающая капсулу хрусталика. Под действием мышцы хрусталик становится более или менее выпуклым. Эпителий ресничного тела вырабатывает прозрачную внутриглазную жидкость, которая вместе с жидкостью, образующейся за счет выхода из капилляров, заполняет переднюю и заднюю глазные камеры, находящиеся впереди хрусталика.

Собственно сосудистая оболочка располагается между склерой и сетчаткой, в ней много кровеносных сосудов.

Внутренняя оболочка, или сетчатка,— рецепторная часть глазного яблока, т. е. своего рода светочувствительный экран.

В сетчатке имеются фоторецепторные, биполярные, ганглиозные нейроны, формирующие радиальную связь, мультиполярные (горизонтальные и амакринные) нейроны, образующие связи в горизонтальном направлении. Из клеток нейроглии в слоях сетчатки имеются лучевые глиоциты Мюллера, также астроциты и клетки микроглии.

В сетчатке различают наружную и внутреннюю части, первая соприкасается с сосудистой оболочкой, а вторая — со стекловидным телом. Во внутренней части, называемой зрительной, располагаются фоторецепторные клетки — палочки и колбочки.

Палочки обладают высокой светочувствительностью и являются рецепторными клетками черно-белого сумеречного зрения, колбочки — цветного дневного. Много палочек находится на периферии зрительной части сетчатки, которая участвует в зрительном процессе при слабом освещении. В сетчатке дневных животных и птиц (дневные грызуны, куры, голуби) содержатся почти исключительно колбочки, у ночных птиц (совы, филины) — преимущественно палочки.

Каждая фоторецепторная клетка состоит из двух сегментов: наружного и внутреннего, в котором сосредоточены ядро и органоиды: митохондрии, эндоплазматическая сеть, полисомы, комплекс Гольджи. Сегменты соединены так называемой ножкой.

Фоторецепторные клетки различаются по форме, количеству, распределению в сетчатке, ультраструктурной организации, а также по типу соединения с отростками.

Наружный сегмент палочки тонкий, длинный, цилиндрический, а у колбочки — короткий и конический. Колбочки центральной ямки — это участки наилучшего восприятия раздражения. Они вытянутой формы, имеют тонкий наружный сегмент, поэтому напоминают палочки.

В наружных сегментах палочек и колбочек содержится множество дисков, состоящих из сдвоенных мембран. В эмбриогенезе диски образуются как складки наружной плазматической мембраны. Затем в палочках связь дисков с наружной мембраной утрачивается, за исключением нескольких базальных.

В колбочках связь дисковых и плазматических мембран сохраняется по всей длине. Многочисленные диски в объеме сегмента ориентированы перпендикулярно длинной оси клетки.

Диски палочек и колбочек содержат молекулы зрительных пигментов, из которых наиболее изучен родопсин, находящийся в палочках позвоночных. Особо много молекул родопсина в мембранах дисков со стороны, обращенной к падающему свету. Поглощение света пигментом представляет собой первое звено в цепи превращений, ведущих к распаду и обесцвечиванию зрительного пигмента, что, в свою очередь, приводит к изменению проницаемости мембраны фоторецептора и возникновению зрительного сигнала.

Мембраны дисков колбочек содержат другие по химическому составу пигменты. Выделяют три типа колбочек, каждый из которых содержит преимущественно только один пигмент, наиболее изучен иодопсин.

Внутренний сегмент у колбочки значительно толще, чем у палочки. Во внутреннем сегменте колбочек имеется участок, состоящий из скопления плотно прилегающих друг к другу митохондрий с расположенной в центре этого скопления липидной каплей — эллипсоидом.

Сетчатка в зрительной части построена из клеток пяти типов: пигментных, фоторецепторных клеток палочек и колбочек, ассоциативных нейронов, ганглиозных и нейроглиальных клеток Мюллера (рис. 66).

Рис. 66. Схема строения сетчатой оболочки:

/—пигментный слой; 2—слой палочек и колбочек; 3 — наружный пограничный слой; 4—наружный ядерный слой; 5 — волокнистый слой Генле; 6— наружный сетчатый слой; 7— внутренний ядерный слой; 8— внутренний сетчатый слой; 9— ганглиозный слой; 10— слой нервных волокон; 11— внутренний пограничный слой

Клетки пяти типов в совокупности образуют 11 слоев, которые заметны при световой микроскопии.

Первый слой — пигментный состоит из одного ряда уплощенных клеток, расположенных на базальной мембране, которая непосредственно соприкасается с сосудистой оболочкой. Ядра размещаются на базальном полюсе клетки. На противоположных апикальных полюсах имеются выросты цитоплазматической мембраны в вице бороды.

В отростках пигментных клеток содержится пигмент меланин, который может перемещаться в цитоплазме и поэтому в зависимости от освещения находиться либо в базальной части (день), либо в отростках клеток (ночь), поглощая большую (до 80 %) часть света. Кроме того, клетки пигментного эпителия обеспечивают поступление питательных веществ и витамина А из сосудистой оболочки к нервным клеткам сетчатки.

Слой палочек и колбочек образован наружными сегментами зрительных (фоторецепторных) клеток, которые окружены отростками пигментных клеток и находятся в матриксе, содержащем гли- козаминогликаны и гликопротеиды.

Наружный пограничный слой представляет собой тонкую нейроглиальную пленку, состоящую из сети отростков гигантских опорных нейроглиальных клеток Мюллера. Эти отростки имеют зазубринки, которыми плотно охватывают длинные тела клеток палочек и колбочек и предотвращают их смещение.

Наружный ядерный слой состоит из скопления ядер, принадлежащих палочкам и колбочкам. Ядра колбочек более светлые и крупные в сравнении с ядрами палочек.

Волокнистый слой Генле образован проксимальными безъядерными отделами клеток палочек и колбочек. Этот слой плохо различим, поэтому обычно он сливается с последующим шестым слоем и граница между ними нечеткая.

Наружный сетчатый слой построен из отростков фоторецепторных клеток, контактирующих с дендритами глубжележащих ассоциативных биполярных и мультиполярных нейронов.

Внутренний ядерный слой состоит из густого скопления ядер, принадлежащих ассоциативным нейронам: горизонтальным, амак- риновым, биполярным. Горизонтальные нейроны располагаются в один или два ряда. Дендриты связаны с отростками колбочек, аксоны имеют горизонтальное направление, с помощью коллатералей образуют связь с отростками палочек и колбочек. Следовательно, функция горизонтальных ассоциативных клеток заключается в том, чтобы принимать импульсы от групп светочувствительных клеток данного участка сетчатки и передавать другим, находящимся в других участках. Один из отростков биполярных клеток, соответствующий дендриту, образует синапс с проксимальными отделами палочек и колбочек.

Внутренний сетчатый слой образован из ветвящихся отростков амакриновых клеток, формирующих ассоциативные связи с денд- ритами ганглиозных клеток. В этом слое аксоны биполярных клеток образуют синапсы с дендритами ганглиозных клеток, расположенных в следующем слое сетчатки.

Ганглиозный слой состоит из одного ряда крупных ганглиозных клеток, в цитоплазме которых много базофильного вещества. Ветвистые дендриты ганглиозных клеток во внутреннем сетчатом

Рис. 67. Схема восприятия внешнего мира зрительным анализатором:

а — относительное расположение нервных клеток сетчатки; б — восприятие сигналов двумя рядом расположенными ганглиозными клетками слое соединяются с аксонами биполярных клеток. Аксоны ганглиозных клеток формируют следующий слой.

Слой нервных волокон состоит из аксонов ганглиозных клеток, образующих общий ствол зрительного нерва.

Внутренний пограничный слой образован расширенными основаниями нейроглиальных клеток Мюллера. Эти клетки называют опорными лучевыми глиоцитами, так как длинные и узкие клетки тянутся через всю толщину сетчатки, ядросодержащие участки их располагаются во внутреннем ядерном слое. Наружные участки лучевых глиоцитов образуют наружную пограничную мембрану, расположенную между слоем палочек и колбочек и наружным ядерным слоем, а расширенные и плотно прилегающие друг к другу внутренние концы — внутреннюю пограничную мембрану, отделяющую сетчатку от стекловидного тела.

Световая волна достигает колбочек и палочек лишь после того, как пройдет почти всю толщу сетчатки. Каждая ассоциативная клетка получает импульсы от нескольких фоторецепторных нейронов, каждый ганглиозный нейрон — от нескольких ассоциативных (рис. 67).

Сигнал, возникший в светочувствительных клетках, передается биполярным, от них — ганглиозным нейронам, аксоны которых формируют зрительный нерв. На вентральной поверхности головного мозга зрительные нервы правого и левого глаз перекрещиваются и продолжаются в виде зрительных путей к подкорковым центрам: коленчатому телу зрительных бугров и ядрам назального отдела четверохолмия. Волокна с аксонами клеток наружного коленчатого тела идут в затылочную область коры больших полушарий, которая является корковым центром зрительного анализатора. Аксоны нейронов зрительного отдела коры головного мозга образуют многочисленные центробежные пути. Часть волокон достигает сетчатки и обеспечивает корковый контроль деятельности нейронов сетчатки.