Поврежденные клетки роговицы лягушки
Удобными
объектами для исследования являются тонкие пленки растительных и животных
тканей, форменные эле менты крови (эритроциты, лейкоциты), изолированные железы
личинок насекомых (хирономуса, дрозофилы), роговица лягушки, отпечатки клеток
печени и др. Для изучения растительных клеток можно рекомендовать так
называемую плаценту или пленку, одевающую семя подсолнечника. После слабого
размачивания сухого семени она легко снимается и может быть подвергнута любым
цитологическим исследованиям.
Очень удобным
материалом для исследования живых клеток являются культуры животных и растительных
тканей и особенно культура лейкоцитов. Преимущество метода культуры тканей
заключается в том, что клетка в условиях культуры оказывается в более
благоприятных условиях, чем в условиях так называемого «переживания». Это
дает возможность вести длительные, не ограниченные временем, наблюдения.
Наконец, в условиях культуры легче найти место, где клетки расположены в один
слой, что является идеальным для тонких наблюдений и при значительных увеличениях.
В качестве
приборов, которые применяют для исследования живых клеток, следует назвать
обычный микроскоп и ряд его модификаций — изучение препаратов с применением
темного поля, фазовоконтрастного устройства, интерференционного и
аноптрального микроскопов. Исключительно интересным для исследования живых
клеток является применение люминесцентного микроскопа.
Проведение
работы с живыми «переживающими» клетками требует соблюдения
определенных мер предосторожности, гарантирующих нормальное состояние клетки.
Животные клетки обычно изучаются в рингеровском или в рингер-локковском солевом
растворе или, наконец, в капле кровяной плазмы того животного, от которого
взята исследуемая ткань. Растительные клетки обычно изучаются в водопроводной
воде или в растворах сахара- Окрашивание производится в чашках Петри при
температуре воздуха 20— 25″С и при определенной концентрации красителя,
которая устанавливается экспериментальным путем, индивидуально для каждой ткани
(примерное разведение красителя 1:1 000; 1:5 000 и т. д.).
С первых же
минут контакта красителя с тканью в цитоплазме неповрежденных клеток
постепенно образуются мелкие гранулы в виде зерен, капелек. С течением времени
количество гранул и их размеры увеличиваются. Ядро остается при этом
неокрашенным. В поврежденных клетках цитоплазма и ядро окрашиваются диффузно.
Весьма
интересным и перспективным является метод двойной витальной окраски,
разработанный на кафедре биологии (И. Е. Камнев, Л. Ф. Гордеева, 1959). Этот
метод заключается в том, что ткани окрашиваются нейтральным красным в сочетании
с азуром I.
Оптимальные
концентрации для различных тканей оказались различными. Так, для эпителия
роговицы лягушки лучшими оказались нейтральный красный в концентрации 0,05% и
азур 1 — 0,1%. Растворы этих красителей готовятся отдельно на дистиллированной
воде, а затем перед экспериментом сливаются вместе в соотношении 10 частей нейтрального
красного и 3 части азура I, после чего смешиваются с равным количеством
двойного солевого раствора Рингера. Преимущество этого метода заключается в
том, что в результате такого окрашивания возникает четко видимая разница между
нормальными и поврежденными клетками. Цитоплазма интактных клеток почти
бесцветна и содержит большое количество гранул нейтрального красного, а поврежденные
клетки диффузно окрашиваются азуром 1 в синий цвет.
Использование
витальных красителей дает возможность судить как о субстанциональных изменениях
исследуемых клеток, так и об их функциональном состоянии. Причем, это
окрашивание позволяет выявить такие тонкие начальные изменения, которые не
обнаруживаются другими методами. Поэтому метод прижизненной окраски нашел широкое
применение для решения и трактовки ряда как общетеоретических, так и прикладных
вопросов.
ТЕМЫ ДЛЯ ДОКЛАДОВ
1.
Прижизненные, или витальные, методы исследования и значение их в биологии и
медицине.
2.
Паранекроз и его биологическая сущность.
ЛИТЕРАТУРА
1.
Камнев И. Е. Пособие по общей цитологии. Часть I, 1968. часть П. 1969.
2. Руководство
по цитологии под ред. Л. Н. Жинкина и П. П. Румянцева’, 1965.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание — внизу страницы.
Источник
ПРИЖИЗНЕННАЯ ОКРАСКА НОРМАЛЬНЫХ И ПОВРЕЖДЕННЫХ
КЛЕТОК
1. Цель занятия
Ознакомить с
методикой прижизненного окрашивания животных и растительных клеток и научиться
отличать нормальные клетки от поврежденных.
2. Материал и оборудование для
занятия
Таблицы клетки
эпителия роговицы лягушки, окрашенные нейтральным красным с азуром; клетки
пленки семени подсолнечника, окрашенные нейтральным красным.
Микропрепараты: поврежденные и
неповрежденные клетки семени подсолнечника, окрашенные нейтральным красным;
поврежденные и неповрежденные клетки эпителия роговицы лягушки, окрашенные
нейтральным красным с азуром.
Влажные семена подсолнечника,
0,15%-ный раствор нейтрального красного, чашки Петри, покровные и предметные
стекла. Микроскопы.
3. Методика проведения занятия
Преподаватель в течение 5—10
минут объясняет студентам цель и план проведения практического занятия, знакомит
с материалом и оборудованием для работы и проверяет общую подготовку студентов
к занятию (20—30 мин.).
В течение
следующих 10 минут студенты изучают методическое указание по данной теме и
только после этого под контролем преподавателя приступают к выполнению практической
работы (70—80 мин.).
В конце занятия преподаватель
подводит итог практической работы, проверяет рисунки и дает задание к следующему
занятию (20—25 мин.).
4. Содержание практической работы
1. Студенты самостоятельно готовят временные препараты
семени подсолнечника, окрашивая их нейтральным красным.
Пленка семени подсолнечника
является двухслойным покровом зародыша, лежащим под плодовой оболочкой семени.
Техника приготовления препарата весьма проста. Предварительно замоченные или
сухие семена подсолнечника освобождаются от кожуры. Затем лезвием бритвы обрезают
оба конца семени и легким нажимом продольно разрезают верхний слой пленки и
снимают ее пинцетом.
Снятая пленка с семени
окрашивается 0,15%-ным раствором нейтрального красного в чашках Петри. В цитоплазме
неповрежденных клеток образуются гранулы нейтрального красного, ядро остается
бесцветным. Поврежденные клетки диффузно окрашиваются в красный цвет, ядро
окрашивается более интенсивно, чем цитоплазма.
Через 20 минут из кусочка пленки
готовят временный микропрепарат и изучают при большем увеличении микроскопа.
2.
Изучить постоянный микропрепарат пленки семени подсолнечника с неповрежденными
клетками при большом увеличении микроскопа. Препарат окрашен нейтральным
красным. На препарате видны неправильной многоугольной формы клетки,
заполненные гранулами нейтрального красного разной величины. На периферии
клетки гранул больше, в центральной части, где находится невидимое в
неповрежденной клетке ядро, их гораздо меньше. Препарат зарисовать.
3. Изучить и зарисовать постоянный микропрепарат
пленки семени подсолнечника с поврежденными клетками при большом увеличении
микроскопа. Препарат окрашен нейтральным красным. На препарате видны клетки
неправильной формы, диффузно окрашенные нейтральным красным. Хорошо видно
ядро, окрашенное более интенсивно, чем цитоплазма. Гранулы отсутствуют.
4.
Изучить постоянный микропрепарат эпителия роговицы лягушки с нормальными и
поврежденными клетками (демонстрация). Препарат окрашен нейтральным красным с
азуром.
Поврежденные клетки имеют
многоугольную форму с четко выраженными границами. Цитоплазма и ядро таких
клеток окрашены в фиолетовый цвет. Ядро окрашено более интенсивно и имеет 1—2
ядрышка. Гранулы нейтрального красного и поврежденных клеток отсутствуют.
Неповрежденные клетки имеют
нечеткие границы и заполнены гранулами нейтрального красного. Структура ядра и
ядрышек в нормальной клетке не видна.
Зарисовать неповрежденные и
поврежденные клетки.
5.
Зарисовать с таблицы схему строения клетки по данным электронной микроскопии.
5. Перечень навыков, приобретаемых студентами
на практических занятиях
1. Закрепить навыки изготовления временных препаратов.
2.
Освоить основы методик прижизненного окрашивания клеток.
3.
Уметь отличать нормальные (интактные) клетки от поврежденных
(альтерированных).
VI. КОНТРОЛЬНЫЕ
ВОПРОСЫ
1.Что такое паранекроз и чем он характеризуется?
2. В чем сущность метода прижизненной окраски нормальных и
поврежденных клеток?
3. В чем заключается метод
двойного витального окрашивания?
Источник
ПАРАНЕКРОЗ
Живая
клетка, входит ли она в состав
многоклеточного организма или представляет
собой одноклеточный организм, находится
в
постоянном взаимодействии с внешней
средой. Всякие воздействия
внешней среды, выходя за пределы
физиологической
нормы для данной клетки, вызывают в ее
протоплазме
характерные реактивные изменения. Эти
изменения в зависимости
от характера и интенсивности действующего
фактора могут иметь все градации от
едва заметных, быстровосстанавливающихся,
до очень глубоких, необратимых.
Паранекроз
(от
греч — para.
возле, мимо, вне, nekros
— мёртвый — вблизи смерти)
— это
совокупность
обратимых неспецифических изменений
в живых клетках, возникающих в ответ на
действие повреждающих агентов,
сопровождающейся нарушением функциональных
свойств клеток. Пограничное состояние
между жизнью и смертью.
Изучение
функциональных и субстанциональных
изменений
в клетке при повреждении было начато
еще в 30-х годах
20 столетия Д. Н. Насоновым. При
действии самых разнообразных физических
и химических раздражителей, применяемых
в определенной дозе, клетка всегда
отвечает одинаковым комплексом
изменений, которые являются выражением
единой реакции,
возникающей в результате воздействия
на клетку любого
агента.
К
числу наиболее типичных изменений живой
протоплазмы,
относятся:
Повышение
вязкости
протоплазмы клеток. Нередко изменение
вязкости бывает двухфазным. При действии
слабых
раздражителей она может уменьшаться,
но при
усилении
раздражителя вязкость начинает
повышаться. На действие раздражителя
размер коллоидной частицы увеличивается.
Уменьшение
степени дисперсности
коллоидов протоплазмы,
что выражается в возникновении в клетке
видимых структур,
Вязкость
повышается, а дисперсность уменьшается,
например, при повреждении клеток, размеры
коллоидных частиц укрупняются, за счёт
набухания и их агрегации. Между размерами
коллоидных частиц и дисперсностью
обратная зависимость.
3.
Подавление
гранулообразующей деятел
ьностии
усиление ее способности связывать
прижизненные красители. При этом
цитоплазма и ядро начинают сильно
прокрашиваться
диффузно, причем, в ряде случаев этот
процесс в ядре выявляется раньше,
чем в цитоплазме.
4.Сдвиг
внутриклеточной реакции цитоплазмы и
ядра в кислую
сторону,
а также выход из альтерированных клеток
различных веществ, например, ионов
калия, магния, кальция,
фосфатов, нуклеиновых кислот и др. и
одновременное
проникновение в клетку ионов натрия и
хлора.
Указанный
комплекс изменений живой протоплазмы,
вызываемый действием повреждающих
(альтерирующих) агентов в обратимой
фазе, был назван Д. Н. Насоновым и В. Я.
Александровым (1934) паранекрозом.
Все
эти перечисленные признаки альтерированной
протоплазмы в
начальной фазе обратимы.
Прекращение действия раздражителя
приводит к “исчезновению” ядерных
и цитоплазматических структур, что
связано с повышением степени
дисперсности коллоидов. Повышенная
способность протоплазмы связывать
краситель исчезает. Цитоплазма и
ядро обесцвечиваются благодаря переходу
красителя в окружающий раствор.
Вязкость протоплазмы понижается.
Вещества, вышедшие из раздраженной
протоплазмы, вновь поступают в клетку.
Если действие альтерирующих агентов
зашло слишком далеко, то вышеописанные
изменения становятся необратимыми,
что приводит клетку к гибели.
В
основе паранекротической реакции живой
протоплазмы лежат
молекулярные изменения ее белков,
близкие по своей природе к начальным
фазам денатурационных изменений нативных
протеинов.
Изменения могут заходить более или
менее глубоко и приводят к ряду процессов,
характеризующих повреждение клетки.
Учение
о паранекрозе широко используется в
разных разделах биологии и медицины и
пополняется все новыми данными. Особого
внимания заслуживают те перестройки и
изменения живой клетки, которые вызываются
разнообразными факторами внешней
среды и наблюдаются при различных
патологических состояниях организма.
Метод
прижизненного окрашивания
Для
определения ответной реакции клеток
при различных повреждающих воздействиях,
наряду с другими цитологическими
методами исследования, широко используется
метод прижизненного окрашивания.
Для окраски живого объекта применяют
витальные
красители,
обладающие минимальной токсичностью.
Прижизненные красители бывают:
а)
кислыми
(трипановая
синь, метиловый кармин)
б)
основными
(нейтральный
красный, янус зеленый, метиленовый
синий).
Различают
также диффузные и гранулярные витальные
красители. Красители вводят животному
либо внутривенно — в этом случае краска
наиболее полно проникает в органы
исследуемого животного, либо окрашивают
изолированные живые ткани.
Удобными
объектами для исследования являются
тонкие пленки растительных и животных
тканей, форменные элементы крови
(лейкоциты), изолированные железы личинок
насекомых, роговица лягушки. Проведение
работы с живыми «переживающими» клетками
требует соблюдения определенных мер
предосторожности, гарантирующих
нормальное состояние клетки.
Животные
клетки обычно изучаются в рингеровском
или в рингер-локковском солевом растворе
или, наконец, в капле кровяной плазмы
того животного, от которого взята
исследуемая ткань.
Растительные
клетки обычно, изучаются в водопроводной
воде или в растворах сахара. Окрашивание
производится в чашках Петри при
температуре воздуха 20 — 25°С и при
определенной концентрации красителя,
которая устанавливается экспериментальным
путем, индивидуально для каждой ткани.
Неповрежденные
клетки.
В
цитоплазме
неповрежденных
клеток образуются мелкие
гранулы красителя в виде зерен, капелек.
Ядро
остается
при этом неокрашенным (воспринимается
как оптическая пустота).
Неповрежденные
клетки (нейтральный красный 1,5 %).
Ядро
не окрашено — оптическая пустота, в
цитоплазме гранулы красителя.
Поврежденные
клетки.
В
поврежденных
клетках цитоплазма
и ядро окрашиваются
красителем диффузно.
Поврежденные
клетки
Ядра
и цитоплазма окрашиваются диффузно
Двойное
витальное окрашивание.
Интересным
и перспективным является метод двойной
витальной окраски, разработанный на
кафедре биологии (И. Е. Камнев, Л. Ф.
Гордеева, 1959). Этот метод заключается в
том, что ткани окрашиваются нейтральным
красным в сочетании с азуром I.
В
основе методаизбирательная
способностьповреждённых
и неповреждённых клеток взаимодействовать
с красителями. Преимущество этого метода
заключается в том, что в результате
такого окрашивания возникает четко
видимая разница между нормальными и
поврежденными клетками на изучаемом
препарате.
Цитоплазма
интактных
клеток почти бесцветна и содержит
большое
количество гранул нейтрального красного.
Ядро
не окрашено. В
поврежденных клеткахцитоплазма
и ядро
диффузно окрашиваются
азуром I
в синий цвет.
Окрашивание
позволяет выявить такие тонкие начальные
изменения, которые не обнаруживаются
другими методами. Поэтому метод
прижизненной окраски нашел широкое
применение для решения и трактовки ряда
как общетеоретических, так и прикладных
вопросов.
3
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
Источник
