Конфокальная микроскопия роговицы это

S.Ae. Avetisov, G.B. Egorova
GU NII of Eye Diseases RAMN, Moscow

Purpose: to study possibilities and information value of confocal microscopy in normal subjects and in patients with some pathologic conditions of cornea.
Materials and methods: Confocal microscopy was performed in 40 subjects (75 eyes) : 6 participants were healthy volunteers with mild myopia, 24 – had keratoconus of I – IV stages,4 patients were after penetrating corneal transplantation, 4– after refractive corneal surgery , 1– after herpetic keratitis, 1– with Fuchs dystrophy. Confocal microscopy was made with «Confoscan – 4,» Nidek (magnification х 500).
Results and conclusion: Confocal microscopy is highly informative non–invasive method, which allows detecting subtle changes on cellular and micro structural levels, studing in details pathogenic mechanisms in various diseases and surgery.

Для успешного решения задач оптической и хирургической коррекции различных рефракционных нарушений большое значение имеет адекватная оценка функционального и морфологического состояния роговой оболочки. Изучение структурных изменений при различных заболеваниях роговицы необходимо также для оценки тяжести патологического процесса, эффективности лечения и определения тактики ведения больного.
В связи с этим целесообразность разработки неинвазивных методов исследования, позволяющих оценить степень морфологических изменений в роговице, является неоспоримой.
В течение последнего десятилетия все большее распространение получают офтальмологические методы диагностики, позволяющие получать информацию с визуализацией результатов исследования. Ультразвуковые методы, компьютерная видеокератография позволили значительно расширить и углубить знания и понятия о различных аспектах болезней роговицы и хирургических процедур.
Одним из наиболее современных методов исследования роговицы является прижизненная конфокальная микроскопия. Данный метод в силу оригинальной конструкции микроскопа и его большой разрешающей способности позволяет визуализировать живые ткани роговицы на клеточном уровне, измерить толщину каждого из ее слоев, оценить количество, форму, размер клеток эпителия, стромы, заднего эпителия роговицы, степень десквамации эпителиальных клеток при воздействии контактных линз и хирургических вмешательств [1 –7].
Цель данного исследования – изучение возможностей и информативности конфокальной микроскопии в норме и при некоторых патологических состояниях роговой оболочки глаза.
Материал и методы исследования
Конфокальная микроскопия роговицы была проведена у 40 пациентов (75 глаз): 6 пациентов (12 глаз) были здоровыми добровольцами или имели миопию слабой степени, 24 (48 глаз) –с кератоконусом 1–4 стадий, 4 пациента (4 глаза) –после сквозной пересадки роговицы, 4 (8 глаз) –после рефракционных операций на роговице, 1пациент (1 глаз) –после перенесенного герпетического кератита, 1 пациент (2 глаза ) –с дистрофией Фукса.
Исследование проводили с помощью конфокального микроскопа «Confoscan – 4», Nidek (увеличение х 500).
Данный прибор позволяет исследовать роговицу по всей ее толщине, размер исследуемой зоны составляет 440 х 330 мкм. Толщина слоя сканирования составляет 5 мкм. Исследование проводится с использованием иммерсионной жидкости, которая находится между роговицей и объективом линзы, в результате чего исключается непосредственный контакт линзы и роговицы и сводится к минимуму риск повреждения эпителия. Проведение данного исследования возможно без применения анестетиков. В качестве иммерсионной жидкости используется гель («Видисик»). Линза с каплей геля подводится к роговице до касания, толщина слоя иммерсионной жидкости должна быть равна 2 мм. Конструкция прибора позволяет исследовать роговицу в центральной зоне и ее парацентральных участках (рис.1, 2).
Результаты проведенных исследований
При обследовании здоровых добровольцев и пациентов с миопией слабой степени получены данные, характеризующие нормальную картину всех слоев роговой оболочки глаза.
Роговичный эпителий состоит из 5–6 слоев и трех разных видов клеток:
1– плоские поверхностные (2–3 слоя);
2 – шиповидные (крылатые) (2–3) слоя;
3 –цилиндрические базальные (1 слой).
Цилиндрические базальные клетки обладают митотической активностью. Средняя толщина всего эпителия приблизительно 50 мкм. С помощью конфокальной микроскопии можно определить особенности различных клеток.
Поверхностный слой эпителия представлен полигональными клетками, обычно с четким ядром, четкими границами и гомогенной плотностью. Ядра обычно ярче, чем окружающая их цитоплазма, также можно различить перинуклеарное темное кольцо (рис. 3).
Базальные клетки – маленькие полигональные, более плотные без четкого ядра и с очень четкими яркими границами (рис.4). Крылатые клетки обладают переходными характеристиками, ядра могут быть нечеткими или могут не определяться.
Боуменова и десцеметова мембраны в норме не визуализируются, т.к. прозрачны и не отражают свет.
Конфокальная микроскопия дает возможность визуализировать волокна нервных сплетений роговицы. Субэпителиальное нервное сплетение находится под боуменовой мембраной. Его нервные волокна, перфорируя боуменову мембрану на уровне базального эпителия, формируют суббазальное нервное сплетение, волокна которого идут поверхностно, обеспечивая иннервацию базального эпителиального слоя, и заканчиваются в области поверхностных эпителиальных слоев.
В качестве критериев оценки нервных волокон используют такие показатели, как плотность, ширина, извилистость, рефлективность, ориентация, ветвление. В норме можно увидеть длинные, параллельно идущие тяжи или пучки нервов [2,7]. Часто нервные волокна яркие, хорошо контрастирующие на фоне непрозрачного темного фона (рис. 5).
Строма роговицы занимает от 80 до 90% толщины роговицы и состоит из 3 основных компонентов: клеточного, бесклеточного и нейросенсорного.
Клеточный компонет в основном состоит из кератоцитов и составляет примерно 5% всего вещества. Бесклеточный –от 90 до 95 % стромы, включает правильные (регулярные) коллагеновые пластинчатые структуры и интерстициальную ткань. Нейросенсорный компонент представлен стромальным глубоким нервным сплетением.
Типичная конфокальная микроскопическая картина стромы включает несколько ярких неправильной овальной формы тел, которые являются ядрами кератоцитов и лежат в толще прозрачного (темно–серого или черного) бесклеточного матрикса. При отсутствии патологических изменений стромы визуализация внеклеточных структур невозможна из–за их прозрачности. Строма может быть условно разделена на субслои: передний (непосредственно под боуменовой мембраной), передне–средний, средний и задний. Средняя плотность кератоцитов выше в передней строме (10% толщины), их количество уменьшается по направлению к задним слоям. Плотность клеток прогрессивно уменьшается от передней (100%) к задней строме (53,7%).
В передней строме ядра кератоцитов имеют округлую бобовидную форму, в задней строме – овальную (рис. 6,7).
В ряде случаев кератоциты имеют различную яркость. Различие в рефлективности зависит от их метаболического возбуждения, поэтому их называют активированными кератоцитами (рис. 8). Их можно обнаружить и в здоровых роговицах – это «стрессовые» клетки, их деятельность направлена на поддержание внутреннего гомеостаза роговицы и они являются типичными для воспалительных и рубцовых процессов (например, при заживлении после эксимер–лазерных операций) [2].
В строме (особенно в передне–средней и средней) возможна визуализация нервных волокон из глубокого роговичного сплетения. Эти волокна визуализируются в виде тонких, ярких рефлектирующих полос, ориентированных либо вертикально, либо по косой параллельно друг другу, часто видна бифуркация в виде буквы Y (рис. 9).
Задний эпителий роговицы выглядит как яркий одноклеточный слой из гексогональных или полигональных плоских клеток. Ядра не определяются, а тело клетки гомогенно яркое, светлое. Края клеток визуализируются, как тонкие серые линии. Чем выше плотность клеток, тем меньше их размер. Возможен мануальный или автоматический подсчет количества клеток, расчет их плотности, площади, коэффициента вариабельности (рис. 10).
При кератоконусе морфологические изменения достаточно многообразны, особенно в области роговицы, вовлеченной в эктатический процесс.
В эпителиальном слое могут определяться различные варианты эпителиопатии. Поверхностные клетки становятся деформированными и вытянутыми в косом направлении, клеточные границы нечеткие. Участки с большей отражательной способностью свидетельствуют о нарушении прозрачности (рис. 11).
Цвет клеток характеризует состояние их жизнедеятельности. Светлые клетки – с более сглаженной поверхностью и большей отражательной способностью, что является следствием их атрофии. Большое количество светлых клеток свидетельствует об их повышенной десквамации (рис. 12).
Неравномерный рефлекс с боуменовой мембраны косвенно свидетельствует о нарушении ее структуры и прозрачности.
В базальном эпителии обнаруживается деформация и неправильность формы клеток и иногда возможно определить небольшие зоны, в которых базальный эпителий отсутствует (рис. 13).
Субэпителиальное нервное сплетение в общем хорошо визуализируется и может иметь нормальную морфологию (рис. 14).
Строма роговицы при кератоконусе всегда вовлечена в патологический процесс: повышенная отражательная способность передних отделов стромы и стрии Вогта в задних отделах стромы являются типичными находками. Основные изменения стромы представлены микростриями, которые выглядят, как разнородные тонкие линии со сниженной отражательной способностью (гипорефлекторные), контрастирующие с более светлой стромой и располагаются внеклеточно.
Эти проявления являются следствием дегенеративных процессов и могут быть микроскладками (как и стрии Вогта) или микротрещинами экстрацеллюлярного матрикса. Микрострии обнаруживаются во всех слоях роговичной стромы. Количество кератоцитов уменьшено, видны их значительные дегенеративные изменения (рис. 15).
Изменения в строме могут быть многообразными. В частности, примером может служить изменение формы и ориентации кератоцитов в средней строме при кератоконусе 3 стадии. Отмечаются наличие большого количества кератоцитов с повышенной отражательной способностью, выраженная тенденция к помутнению (рис. 16).
Необходимо отметить, что чем больше выражены клинические признаки кератоконуса и тяжелее патологический процесс, тем большие изменения выявляются при конфокальной микроскопии.
С помощью данного метода можно исследовать состояние трансплантата после операции сквозной пересадки роговицы. Изменения могут быть разнообразными и выраженными в различной степени. На рисунке 17 представлена картина передней стромы роговичного трансплантата: визуализируются кератоциты с нечеткими размытыми границами, выявляются участки стромы с пониженной прозрачностью, что может быть следствием дистрофического процесса с элементами отека. В различных слоях трансплантата могут определяться стромальные складки (рис.18).
На рисунке 19 представлен пример морфологической картины после операции кератомилеза. Можно отметить снижение прозрачности стромы роговицы, нарушение архитектоники волокнистых структур, очень малое количество кератоцитов, нечетко контурируемых. Яркие рефлектирующие точки являются включениями металлической пыли, которые образовались, по–видимому, в результате использования режущего инструмента низкого качества. При биомикроскопии в этом случае можно видеть световые блики. Кроме этого, можно выявить участки помутнения в области боуменовой мембраны, отек нервных волокон и другие изменения (рис. 20).
Герпетические поражения роговицы приводят к грубым структурным изменениям. На рисунке 21 представлены изменения роговицы после перенесенного герпетического кератита (при биомикроскопии выявляется облачковидное помутнение в эпителии и субэпителиальных слоях). Морфологические изменения характеризуются отсутствием различимых межклеточных границ, большим количеством рефлексирующих зон, что свидетельствует о появлении новых характеристик эпителиальной ткани, связанных с явлением кератинизации. Возможно, причиной является нейротрофический процесс, вызывающий понижение структурной и функциональной организации эпителия.
На рисунке 22 представлены изменения, характерные для тяжелого поражения эндотелия с формированием поверхности по типу шагреневой кожи при дистрофии Фукса.
Таким образом, можно утверждать, что конфокальная микроскопия является высокоинформативным неинвазивным методом исследования, позволяющим выявить тонкие изменения роговицы на клеточном и микроструктурном уровне, более полно изучить патогенетические механизмы при различных заболеваниях или хирургических вмешательствах.
Метод дает возможность детального изучения и визуализации всех роговичных структур. Дальнейшие исследования должны быть направлены на накопление материала и стандартизацию микроскопической картины роговицы в различных клинических ситуациях.

    Конфокальная микроскопия нашла широкое применение в офтальмологии, прежде всего для оценки состояния роговицы [1, 2, 6 —10]. Существует несколько типов этих аппаратов – тандемно —сканирующие, щелевые, лазерные. В настоящей работе был использован конфокальный микроскоп с щелевыми полевыми диафрагмами – «Confoscan 4» японской фирмы Nidek, имеющий разрешающую способность 1 мкм. Некоторые преимущества в сравнении с ним имеет аппарат компании Heidelberg Engineering – лазерный конфокальный микроскоп для переднего и заднего отдела HRT 3. Корнеальный модуль этого прибора – RCM (Rostock Cornea Module) – в отличие от других дает возможность исследовать не только центральную зону роговицы, но и все поверхностные структуры, а также передний сегмент глаза [9, 10].

    Тем не менее, при использовании того или иного конфокального микроскопа спорным остается вопрос трактовки изображений, получаемых в ходе обследования пациентов с различной офтальмопатологией. На сегодняшний день существует несколько атласов, созданных зарубежными разработчиками, производителями приборов и отечественными исследователями [2, 10]. Однако анализ литературы и участие в научно —практических конференциях выявили расхождение точек зрения разных ученых в вопросах интерпретации снимков конфокальной микроскопии.

    Цель – проанализировать возможные причины разных трактовок результатов конфокальной микроскопии. На примере изменений после LASIK изучить особенности интерпретации снимков различных слоев роговицы. Оценить перспективы дальнейшего развития данного диагностического метода.

    Материал и методы

    Под наблюдением находилось 22 пациента (44 глаза), из них 19 женщин, 3 мужчин. Средний возраст на момент обследования составил 31 год (от 23 до 39 лет). Всем пациентам был выполнен LASIK по стандартной технологии на установках MEL —60 (Aesculap Meditec, Германия), MEL —80 (Carl Zeiss, Германия) с формированием роговичного лоскута при помощи автоматических микрокератомов LSK Evolution M1, LSK Evolution M2 (Moria, Франция) [3]. До операции пациенты имели миопию различной степени, срок наблюдения был от 4 до 10 лет. Контрольная группа, сопоставимая по количеству, полу и возрасту, состояла из не оперированных добровольцев с эмметропией.

    Для оценки ультраструктуры роговицы использовался щелевой конфокальный микроскоп «Confoscan 4», позволяющий визуализировать послеоперационные изменения на клеточном уровне и проводить пахиметрию различных субслоев с помощью Z —кольца.

    Ранее мы сообщали о выраженном увеличении толщины роговицы через 10 лет после LASIK [4, 13]. Ряд ученых получили схожие результаты в более ранние сроки [11, 14]. В ходе исследования мы измеряли толщину нативных и вновь сформированных слоев роговицы.

    Интерфейс между лоскутом и ложем роговицы распознавался благодаря дебрису, низкой оптической плотности и складкам роговичного лоскута – стриям.

    Отдельно измеряли толщину эпителия и стромы. Оценивали плотность и рефлективность кератоцитов. Подсчитывали плотность эндотелиальных клеток, анализировали их форму и размер. При наличии жалоб на сухость глаз обращали внимание на состояние субэпителиального и суббазального нервных сплетений.

    Результаты и обсуждение

    Типы конфокальных микроскопов различны (лазерные, тандемные, микроскопы с щелевыми полевыми диафрагмами и др.), но для точного послойного измерения толщины роговицы все они требуют контакта датчика с исследуемой поверхностью. При этом наличие иммерсионной среды между роговицей и датчиком, даже при обследовании не оперированной здоровой ткани, зачастую не предотвращает повреждения роговицы (эпителиальные эрозии). Это связано с тем, что сканирование в таком режиме чаще всего проводится автоматически. Кроме того, пациент не всегда адекватно следит за фиксационной меткой.

    В этой связи значения общей толщины роговицы по данным конфокальной микроскопии сильно варьировали от измерения к измерению. Оценка толщины субслоев роговицы могла быть сделана лишь приблизительно, учитывая процентное соотношение общей толщины роговицы и исследуемой зоны. Применение Z —кольца и, соответственно, достаточно длительная аппланация роговицы и ее продавливание в зоне исследования, с нашей точки зрения, определяют разницу значений конфокальной пахиметрии и результатов, полученных с помощью других приборов для измерения толщины роговицы [5]. Достоверные значения толщины эпителия могли быть получены только при хорошей фиксации пациентом метки и в отсутствии боковых движений Z —кольца, которые часто вызывают эпителиальные эрозии.

    Гиперрефлективность и утолщение нервных волокон субэпителиального и суббазального нервного сплетения в разные сроки после LASIK, которые были выявлены нашими исследованиями и рядом отечественных и зарубежных авторов, могут являться показателем активного регенерационного процесса [12]. Тем не менее, толщина и количество поперечных связей между нервными волокнами с большей достоверностью, чем рефлективность, отличали нормальную нервную ткань от находящейся в процессе восстановления.

    У всех пациентов после LASIK, независимо от времени, прошедшем после операции, в той или иной степени определялись высокорефлективные кератоциты – «стрессовые» клетки. По данным литературы, плотность кератоцитов прогрессивно уменьшается от передней части стромы к задней [2, 10]. В нашем исследовании рефлективность кератоцитов была одинакова высокой по всей толще стромы, что, возможно, является признаком продолжающего восстановительного процесса.

    С другой стороны, существуют разные точки зрения на оценку рефлективности кератоцитов. Нет единого мнения о том, что означает гиперрефлективность – активный метаболический процесс, апоптоз кератоцитов, погрешность метода и т.д. Отметим, что при использовании конфокального микроскопа с щелевыми диафрагмами достаточно трудно визуализировать прозрачную боуменову и десцеметову мембраны. Однако при фокусировке на них светового луча микроскопа может происходить сильное светорассеяние, что приведет к значительному увеличению рефлективности кератоцитов, нервных волокон и клеток Лангерганса, находящихся вблизи этих мембран.

    При исследовании эндотелия здоровых добровольцев и пациентов после LASIK патологических изменений выявлено не было. Прежде всего, нами проводилась визуальная оценка плеоморфизма и полимегетизма эндотелиальных клеток. При представлении результатов конфокальной микроскопии эти параметры не менее значимы, чем плотность эндотелиальных клеток. В частности, этот параметр у одного пациента может сильно отличаться при проведении нескольких повторных исследований. При этом прибор чаще всего оценивает не более 50 клеток, что, с нашей точки зрения, недостаточно для того, чтобы делать вывод о состоянии тысяч клеток, находящихся на одном квадратном миллиметре роговицы. В связи с этим визуальная оценка состояния эндотелия и сравнение парных глаз с определением на исследуемом участке процентного соотношения гексагональных клеток и клеток, имеющих атипичную форму, а также их размера, представляется важным диагностическим этапом.

    Выводы

    1. Конфокальная микроскопия роговицы открывает широкие возможности для научных исследований. Тем не менее, отсутствие стандартизации подходов к интерпретации результатов замедляет внедрение метода в клиническую практику.

    2. Применение конфокальной микроскопии для изучения структуры различных слоев роговицы после LASIK позволяет оценивать ответ оперированной ткани на вмешательство, в том числе в отдаленном послеоперационном периоде.

    3. Дальнейшее накопление опыта использования конфокальной микроскопии при различных видах офтальмопатологии, а также проведение мультицентровых исследований позволит выработать единый подход к трактовке снимков, получаемых с помощью данного диагностического метода.